Сакс Д. Микробы хорошие и плохие. Наше здоровье и выживание в мире бактерий. Джессика Снайдер Саксмикробы хорошие и плохие. Наше здоровье ивыживание в мире бактерий

анализатор (называемый GeneXpert, цена сорок тысяч долларов) для компании Cepheid. Хотя теоретически такие устройства позволяют амплифицировать и выявлять характерные фрагменты ДНК любых микробов, а также их генов устойчивости к антибиотикам, в настоящее время только два подобных аппарата, позволяющих делать ПЦР “в реальном времени”, то есть быстро амплифицировать гены, одобрены Управлением пищевых продуктов и медикаментов США. То устройство, которое тестировал Эдвардс, получило одобрение в середине 2006 года. Второе, позволяющее за два часа находить стафилококков,
знаменует собой следующий шаг в развитии методов быстрой диагностики, потому что позволяет определять также характер устойчивости: оно не только говорит врачам, имеется ли у пациента золотистый стафилококк, но и сообщает им, есть ли у него устойчивость к метициллину (во многих крупных медицинских учреждениях она отмечается уже более чем у половины стафилококков). Когда врачи вынуждены проводить такие анализы старомодным способом (выращивая бактериальные культуры, как это делал еще Пастер больше века назад,
а затем проверяя их реакцию на различные антибиотики), на получение результатов может уходить до трех дней в течение которых врачам приходится страховаться на все возможные случаи, используя самые мощные антибиотики из своего арсенала.
Многие специалисты называют появление таких устройств, как GeneXpert, прорывом –
не столько за саму возможность проводить с их помощью ДНК-дактилоскопию, сколько за простоту их использования. За последние годы одобрение Управления пищевых продуктов и медикаментов получили уже около дюжины методов генетического анализа. Но до сих пор все эти методы требовали проведения сложных лабораторных манипуляций, а на получение результатов уходило не меньше чем полдня. “Если мы хотим, чтобы больше врачей,
особенно терапевтов, руководствовались, прописывая лекарства, точной диагностикой, –
говорит Роберта Кэри, специалист по диагностической микробиологии из ЦКЗ, – нужно сделать методы диагностики настолько простыми, чтобы даже в самый неудачный день врач мог отвлечься на телефонный звонок, проводя анализ, и все равно получить правильные результаты. Причем быстро, иначе врачи не станут этим заниматься”.
Джим Кинг как семейный врач соглашается с таким выводом: “Я хочу иметь возможность выписать пациенту рецепт сейчас, а не через пару дней”. Такие аппараты для обнаружения последовательностей ДНК, как GeneXpert от компании Cepheid, пока остаются слишком дорогостоящими для использования вне больниц, и в распоряжении терапевтов на сегодня имеется лишь один экспресс-метод микробиологической диагностики, которым можно пользоваться, не выходя из кабинета: RapidStrep, позволяющий минут за десять выявлять наличие пиогенного стрептококка в мазке, взятом с горла пациента. Этот метод находит не ДНК, а крупные молекулярные маркеры, расположение на скользкой капсуле,
покрывающей стафилококков данного вида. Даже один такой анализ, если добросовестно его проводить, мог бы заметно сократить количество неоправданно прописываемых антибиотиков, а тем самым и скорость выработки устойчивости у микробов в организмах пациентов, с которыми работает каждый врач.
Насколько заметно,
можно судить по результатам недавних практических экспериментов, в ходе которых французские исследователи провели в ряде небольших городов мощную информационную кампанию, разъясняя детям в детских садах, их родителям и врачам, как важно осмотрительно использовать антибиотики. Они особенно подчеркивали, что нельзя лечить с их помощью болезни горла, если быстрый анализ на антигены не выявит присутствия пиогенного стрептококка – единственной бактерии,
нередко вызывающей боли в горле (которые в подавляющем большинстве случаев связаны с вирусами).
К концу этой четырехмесячной кампании использование антибиотиков в данных городах упало почти на 20 %. Более того, исследователи отметили также резкое падение устойчивости к антибиотикам у другой бактерии – пневмококка, одного из главных возбудителей пневмонии и менингита, а также хронических ушных инфекций. В тех городах,
где добросовестное использование экспресс-метода анализа на стрептококков привело к

снижению объема прописываемых антибиотиков, доля носителей устойчивых штаммов пиогенного стрептококка среди детей в детских садах, исходно составлявшая больше половины, теперь оказалась немногим больше трети.
К сожалению, в распоряжении врачей имеется лишь очень скромный набор антигенных экспресс-методов, подобных десятиминутному анализу на стрептококков, поскольку эффективность таких методов зависит от наличия у бактерии довольно большого и сложного поверхностного антигена. У большинства бактерий такие молекулярные “рекламные панели”
отсутствуют.
Другая, даже более серьезная проблема с подобными анализами (как на антигены, так и на характерные гены) состоит в том, что они не позволяют врачу узнать, что еще может быть причиной расстройства, говорит Майкл Данн, заведующий отделением клинических разработок фармацевтического гиганта Pfizer в Нью-Лондоне (штат Коннектикут). “Если пренебречь всеми остальными микробами и сосредоточиться на борьбе с тем, которого выявил анализ, есть риск, что пациент тем временем умрет от чего-нибудь другого”, –
объясняет он. Например, рана, зараженная стафилококком, может быть одновременно заражена также пиогенным стрептококком или синегнойной палочкой, причем любой из этих микробов, если им пренебречь, способен вызвать смертельное заражение крови.
Данн говорит, что ему хотелось бы дать исследованиям в области антибиотиков,
проводимым компанией Pfizer, новое направление, отойдя от средств широкого спектра действия и обратившись к поискам “снайперских пуль”, готовых уничтожать лишь микробов определенного вида. В то же время он отмечает, что это может произойти лишь в том случае,
если в распоряжении врачей окажутся методы точной диагностики, позволяющие выявлять у пациента широкий спектр микробов и определять, к каким антибиотикам они восприимчивы.
Совсем другой Майкл Данн (совпадение имен и интересов оказалось чистой случайностью), специалист по молекулярной микробиологии из Университета Вашингтона в
Сент-Луисе, описал как раз такое приспособление в одном из номеров Journal of Clinical
Microbiology за 2003 год24. В своем откровенно футурологическом очерке второй Данн описывает обычное утро 2025 года терапевта Джеффри Лейна, три года назад окончившего медициною школу. Лейн берет мазок с горла шестнадцатилетнего ^ноши, который жалуется на сильные боли при глотании, головную боль и тошноту. Проведя тампоном по миндалинам пациента, Лейн вставляет этот тампон в портативный аппарат для диагностики инфекционных заболеваний – на вид чем-то похожий на устройство, которым пользуется доктор Леонард Маккой из сериала “Звездный путь”.·Затем Лейн вставляет в ручку аппарата одну из пяти деющихся в его распоряжении кассет – предназначенную для респираторных инфекций. Внутренности этой кассеты набиты генными зондами, позволяющими выявлять более 150 разновидностей бактерий, вирусов и грибов, известных как возбудители подобных инфекций, а также несколько тысяч бактериальных генов разных форм патогенности и устойчивости к антибиотикам. В другом отделении аппарата установлены молекулярные зонды, позволяющие находить белки и другие молекулы, по которым можно определить,
работают ли какие-либо из этих генов, синтезируя токсины или ферменты, деактивирующие антибиотики (признак того, что содержащая эти гены бактерия – не случайный свидетель, а возбудитель заболевания). Пациент покидает кабинет врача через пятнадцать минут, после того как диагностическое устройство обнаруживает у него больше дюжины ДНК- и
РНК-последовательностей, специфических для пиогенного стрептококка, и определяет, что данный микроб устойчив к
пенициллинам,
метициллинам,
цефалоспоринам и
стрептограминам. Получив эти сведения, Лейн выписывает пациенту старомодный бета-лак- там в сочетании с ингибитором бета-лактамазы.
Со времени публикации этого очерка исследователи протестировали три прототипа подобного диагностического устройства, один из которых уже близок к поступлению в продажу. Появление первого из них, ДНК-микрочипа разработанного учеными из
Ливерморской национальной лаборатории им. Э. Лоуренса, связано с угрозой биотерроризма. Этот микрочип позволял за шесть часов одно, временно проверять образец

на наличие восемнадцати различных смертельных микробов и вирусов, в том числе одиннадцати разновидностей бактерий, от Bacillus anthracis (возбудителя сибирской язвы) до
Yersinia pestis (возбуди- теля чумы)25. Делалось это путем поиска генов 16S рРНЦ любого из этих микробов (видоспецифичного признака, которым микробиологи пользуются при сортировке смешанных образцов неизвестных бактерий, – см. часть 2). “Для 2002 года это был впечатляющий результат, – говорит Том Слезак, специалист по биоинформатике из
Ливерморской лаборатории. – Но теперь мы знаем, что возможности анализов по 165 рРНК
ограниченны. В некоторых случаях они даже не позволяют надежно определять вид”. Еще более важным препятствием на пути клинического применения подобных микрочипов,
добавляет Слезак, была стоимость их использования: проверка каждого образца обходилась в несколько сотен долларов. И все же этот прототип остается важным достижением:
стоимость ДНК-микрочипов с каждым годом падает, а более информативные генные мишени уже найдены и ждут внедрения в технологии следующего поколения.
Вторая попытка получить что-то похожее на описанный Данном MyCrobe была сделана в 2004 году в Медицинском и стоматологическом университете Нью-Джерси для выявления особо устойчивых к антибиотикам и наиболее смертоносных штаммов стафилококков.
Разработанное сотрудниками университета устройство позволяло проверять взятые у пациентов образцы на наличие шести бактериальных генов. Наличие первых трех из них подтверждало присутствие в образце золотистого стафилококка, а остальные указывали на устойчивость к метициллину, устойчивость к ванкомицину и синтез токсина – лейкоцидина
Пантона – Валентайна. Менее чем за три часа анализ давал результаты в виде набора разноцветных светящихся точек. Проблема была в том, что по этим мерцающим точкам исследователи не могли сказать, имеются обнаруженные гены устойчивости у золотистого стафилококка или же у какого-то “случайного свидетеля” – другой бактерии из того же образца. Например, гены устойчивости к метициллину встречаются также у кожного микроба Staphylococcus epidermidis, а гены устойчивости к ванкомицину распространены у внутрибольничных штаммов кишечных бактерий энтерококков.
В 2005 году биотехнологическая компания GeneOhm из Сан-Диего начала тестировать метод второго поколения для диагностики MRSA, в котором используется изящное решение проблемы “какой ген у какого микроба”. Анализ образцов на предмет наличия MRSA,
занимавший два часа, проводился с помощью двух сцепленных друг с другом ДНК- зондов,
один из которых соединялся с отрезком ДНК, связанным с устойчивостью к метициллину, а другой – с видоспецифичным геном золотистого стафилококка. Поскольку сдвоенный зонд не может дотянуться до двух удаленных мишеней одновременно, такой анализ дает положительный результат только в том случае, если обе мишени расположены на одной хромосоме (то есть имеются у одного итого же микроба)29. В 2007 году, когда пишутся эти строки, данное приспособление уже успешно прошло клинические испытания и имеет неплохие шансы получить одобрение Управления пищевых продуктов и медикаментов.
“Я полагаю, – говорит Майкл Данн из компании Pfizer, – что мы стоим сейчас на пороге настоящего прорыва в диагностике, который позволит нам получать антибиотики,
действующие даже не на единственный вид, а на единственный штамм, быть может – даже единственный организм.
Необходимость истреблять всех “хороших” стрептококков в горле у пациента, чтобы избавить его от “плохого” пиогенного стрептококка, безвозвратно уйдет в прошлое”.
Антибиотики с выключателем
В то же время не исключено, что существуют способы, которые позволят врачам не отказываться от антибиотиков широкого спектра действия, при этом, по крайней мере отчасти, уменьшив тот вред, который приносят данные антибиотики. Финская фармацевтическая компания Ipsat разработала “ферменты для защиты кишечника”,
расщепляющие остатки антибиотиков прежде, чем они попадут через желчный пузырь в

толстую кишку, где обитает подавляющее большинство наших кишечных бактерий. Первые испытания как на животных, так и на людях показали, что такой деактивирующий фермент не снижает эффективности антибиотиков там, где они нужны (в тканях), но при этом предотвращает нарушения и повышение устойчивости, обычно вызываемые антибиотиками в
кишечной микрофлоре.
К
настоящему времени компании удалось получить деактивирующие ферменты для пенициллинов и таких антибиотиков широкого спектра действия, как цефалоспорины и карбапенемы, на которые приходится почти половина всех прописываемых людям антибиотиков. Однако подобные ферменты действенны только при введении антибиотиков внутримышечно или внутривенно, то есть прекрасно подходят для госпитализированных пациентов, но не особенно помогут тем, кто принимает их через рот.
В случае же антибиотиков, принимаемых орально, которые усваиваются в пищеварительном тракте, задача оказывается противоположной – сделать так, чтобы они были неактивны до того, как будут усвоены. Лекарства, которыми удается этот трюк,
называют пролекарствами. \ ним относятся, например, такие известные медикаменты, нб относящиеся к антибиотикам, как леводопа (средство, помогающее при болезни Паркинсона,
оно начинает действовать только после попадания в мозг) и некоторые препараты для химиотерапии при злокачественных опухолях " они делаются токсичными, только оказавшись вну- три опухоли. Одни из первых антибиотиков-пролекарств появились в начале девяностых годов, когда биохимики приступили к работе над улучшением усвояемости новых сильнодействующих антибиотиков из класса цефалоспоринов, чтобы их можно было принимать в виде таблеток, а не вводить внутримышечно или внутривенно. Они обнаружили, что усвояемость цефалоспорина сильно улучшается, если присоединить к определенному участку его молекулы небольшой довесок (сложный эфир). Дальнейшая работа позволила научиться присоединять к молекулам цефалоспорина сложные эфиры,
которые немедленно отваливались, как только антибиотик оказывался внутри кишечных тканей, и переставали мешать его работе.
Случайным побочным эффектом таких разработок стало появление ряда антибиотиков,
не вызывающих “расстройства кишечника”, то есть поноса, начинающегося, когда от антибиотиков погибают бактерии, помогающие нашему пищеварению. У некоторых антибиотиков-пролекарств обнаружилось и еще одно дополнительное достоинство: они выводятся из организма преимущественно с мочой, а не с желчью через кишечник, а значит,
не трогают кишечную микрофлору ни на пути внутрь, ни на пути наружу. Кроме того,
повышенная концентрация в моче делает их особенно эффективными против инфекций мочевых путей.
Исследования, проведенные в Европе, где антибиотики- пролекарства уже приобрели популярность, подтвердили, что такие пролекарства, как пивмециллинам или бакампц циллин, не оказывают сильного воздействия на бактерир, обитающих в ротовой полости,
носоглотке и пищеварительном тракте. Пивмециллинам особенно популярен в Швеции,
Дании и Норвегии, где он стал основным лекарство^ от инфекций мочевых путей –
благодаря низкому уровню устойчивости к нему возбудителей (от которой страдают по всему миру многие женщины, больные хроническими формами подобных инфекций).
Однако в США антибиотики-пролекарства еще предстоит внедрять: лишь немногие из американских врачей когда-либо слышали о таких препаратах.
Подавление устойчивости
Минимизация сопутствующего ущерба от применения антибиотиков может замедлить дальнейшую выработку устойчивости к ним, но не обязательно позволит снизить тот уровень устойчивости, которого микробы уже достигли на сегодняшний день. Надежды на то, что бактерии будут избавляться от генов устойчивости, как только перестанут в них нуждаться, давно пришлось похоронить. Теперь нам известно, что устойчивые к антибиотикам бактерии могут вполне успешно конкурировать со своими неустойчивыми

родичами даже в организме человека, не прикасавшегося к антибиотикам уже не один месяц или не один год.
Хотя и наивно было бы надеяться на то, что нам когда-либо удастся вернуть те следовые количества устойчивости, которые наблюдались до внедрения пенициллина, рано или поздно у нас в распоряжении могут оказаться технологии, позволяющие избирательно выключать бактериальную устойчивость, подавляя ген за геном и инфекцию за инфекцией.
Одно из перспективных направлений последний в этой области касается “плазмидных рвотных” – химических соединений и других средств, побуждающих бактерий извергать из себя плазмиды – эти колечки ДНК, которыми они обмениваются, нередко под завязку набитые генами устойчивости. Первые попытки “лечить” от плазмид бактерий, устойчивых ко многим антибиотикам, были предприняты в семидесятых годах, когда микробиологи только начали разбираться в том, что представляют с0бой эти “факторы устойчивости”. В
лабораторных условиях исследователям иногда удавалось очищать колонию бактерий от устойчивости к антибиотикам, воздействуя на нее токсичными веществами, например акридиновыми красителями, едкими детергентами или таким канцерогеном, как бромистый этидий.
В то время подобные токсичные вещества казались совершенно непригодными для лечения пациентов. Что серьезные побочные эффекты некоторых антибиотиков,
используемых сегодня в качестве последнего средства, заставили ученых вернуться к исследованиям препаратов, очищающих бактерий от плазмид. Например, припадки, к которым иногда приводит антибиотик имипенем, считаются теперь “допустимым” побочным эффектом при лечении инфекций, вызываемых устойчивыми к ванкомицину энтерококками или устойчивыми ко многим антибиотикам псевдомонадами (Pseudomonas) или ацинетобактерами (Acinetobacter). К сожалению, ни одно средство “лечения от плазмид” не действует ни на все разновидности плазмид, ни даже на большинство из них, а некоторые бактерии носят с собой сразу несколько их разновидностей.
Более безопасный и более эффективный подход будет, возможно, найден благодаря исследованиям механизмов, позволяющих бактериям передавать свои коллекции плазмид дочерним клеткам. Бактерии, как и все клетки размножаются делением, хотя механизм деления у них намного проще, чем у более крупных и сложнее устроенных клеток растений и животных. Оказывается, плазмиды содержат собственный генетический аппарат для независимого удвоения и наследования. Более того, они должны жестко контролировать этот процесс: при каждом делении клетки в ней всегда должно быть достаточно плазмид, чтобы раздать их следующему поколению, но не слишком много, чтобы их количество внутри отдельной бактериальной клетки не стало чрезмерным.
Пол Хергенротер, долговязый химик-вундеркинд из Иллинойсского университета,
считает, что сложность механизма размножения плазмид дает ученым достаточно возможностей испортить этот механизм – либо заставив плазмиды “думать”, что их слишком много (и тем самым выключив их удвоение), либо приведя в негодность их аппарат распределения копий по дочерним клеткам36. В 2006 году исследовательской группе
Хергенротера удалось реализовать первый из этих двух вариантов с помощью молекул небольшого, похожего на антибиотик вещества апрамицина, имитирующего сигнал о том,
что плазмид стало слишком много. В клетках кишечной палочки, которым в среду добавляли это вещество, плазмиды устойчивости переставали удваиваться, и с каждым новым поколением дочерним клеткам доставалось все меньше плазмид. После смены примерно 250
поколений (кишечные палочки делятся в среднем раз в двадцать минут) в их колониях почти не осталось плазмид, и они стали вполне уязвимы для антибиотиков, которые еще три дня назад не оказывали на них никакого действия. Ясно, что врачам понадобится более быстродействующее средство для очистки бактерий от плазмид, если они будут использовать его в сочетании с антибиотиками. Но успех Хергенротера стал важнейшим шагом в этом направлении.
Другой способ борьбы с такими плазмидами состоит в том, чтобы найти гены,

используемые некоторыми бактериями для включения и выключения содержащихся в этих плазмидах генов устойчивости. Такая “индуцируемая устойчивость” создает ужасные проблемы при лечении некоторых Разновидностей бактериальных инфекций, потому что их возбудители могут, судя по результатам лабораторных анализов, казаться восприимчивыми к определенному антибиотику, а во время лечения пациента неожиданно включать гены устойчивости. Однако выключатели этих генов привлекают медиков как перспективные мишени для средств, подавляющих устойчивость микробов к антибиотикам. Например, в английском Бристольском университете специалистка по молекулярной биологии Вирве
Энне занимается поисками выключателя, который в нормальных условиях подавляет активность целой плазмиды устойчиво- стиукишечной палочки. Эта плазмида, когда она включена, делает кишечную палочку неуязвимой для тетрациклина, ампициллина,
стрептомицина и сульфаметоксазола – четырех антибиотиков из числа наиболее широко используемых в медицине. К началу 2007 года исследовательнице удалось сузить область поисков “регуляторного переключателя” этой плазмиды до одной из нескольких групп генов.
Когда она найдет этот переключатель, следующая ее задача будет состоять в том, чтобы разобраться, какого рода сигналы его запускают и как их можно заблокировать.
Разумеется, плазмиды – не единственное хранилище генов устойчивости. Некоторые из таких генов, попадая в бактерию на плазмиде, тут же перескакивают в главную хромосому.
Другие возникают в результате мутаций или встраиваются в хромосому вместе с ДНК
бактериофагов (вирусов, которые заражают бактерий) или конъюгативных транспозонов
(своего рода перескакивающих генов). Надежда во всех этих случаях прежде всего на один или несколько методов прямого выключения генов – на так называемые антисмысловые генетические технологии. Эти технологии предполагают искусственное создание фрагментов
ДНК с обратной последовательностью, блокирующих работу соответствующих генов.
Самым известным примером применения таких технологий был не имевший коммерческого успеха сорт помидоров “Флавр-Савр”, выведенный в начале девяностых. Специалисты по генной инженерии получили этот медленно созревающий сорт, введя в него антисмысловой ген, частично блокировавший синтез гормона созревания, что позволяло фермерам собирать уже зрелые (а значит, более ароматные) помидоры, не боясь, что они сгниют по дороге к покупателю. Незначительно улучшенного аромата оказалось недостаточно, чтобы преодолеть недоверие покупателей к генетически модифицированному “Франкенфрукту”, но сам факт его получения был выдающейся демонстрацией возможности антисмысловых технологий.
Примерно в то же время, когда “Флавр-Савр” совершал свой непродолжительный дебют, команда Стюарта Ливи в Университете Тафтса начала работу над созданием анти- смыслового гена, блокирующего работу гена устойчивости ко многим антибиотикам mar
(multiple-antibiotic-resistance),
обнаруженного у
множества близкородственных болезнетворных микробов, в том числе сальмонелл (возбудителей пищевых отравлений),
шигелл (возбудителей бактериальной дизентерии), чумных палочек (возбудителей чумы) и дюжины с
лишним возбудителей внутрибольничных инфекций:
энтерококков,
цитробактеров, серраций и клебсиелл. Ген таг представляет собой своего рода центральный переключатель для целого набора генов устойчивости,
делающих микробов невосприимчивыми к десяткам антибиотиков, от давних стандартных средств, таких как тетрациклин и ампициллин, до перспективных новых препаратов таких как норфлоксацин.
Ливи и его коллеги встроили Щученный антисмысловой ген к гену таг в плазмиды помощью минутного повышения температуры до 42 °C и электрического импульса побуждали клетки кишечной палочки поглощать такие плазмиды. Этот метод, конечно, нельзя было использовать на практике для борьбы с болезнетворными микробами, но он открывал многообещающее новое направление исследований.
Но с тех пор как Ливи продемонстрировал саму подобную возможность, ряду других ученых удалось добиться аналогичных результатов, побуждая бактерий в пробирках поглощать антисмысловые последовательности, лишавшие их устойчивости к ванкомицину

в одном эксперименте и к амикацину в другом. (Амикацин – довольно токсичное средство,
особенно часто применяемое при тяжелых формах внутрибольничных инфекций,
устойчивых ко всему остальному.) Как и в случае с методами чистки от плазмид, конечный успех работ, ведущихся в этом направлении, целиком и полностью зависит оттого, удастся ли найти практические способы заставить бактерий делать то, что от них требуется, в организме пациента. С другой стороны, обнадеживает то, что микробиологи в настоящее время исследуют сразу несколько возможных способов введения антисмысловых генов в бактериальные клетки. Например, такие гены можно упаковывать в бактериофагов, или заключать в маленькие жировые пузырьки, легко проходящие через клеточные стенки бактерий.

перейти в каталог файлов