Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу Цитогенетика
 Скачать 2.5 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова Факультет биоинженерии и биоинформатики Алиева И.Б., Киреев И.И., Курчашова С.Ю., Узбеков Р.Э. Методы клеточной биологии, используемые в цитогенетике. Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу «Цитогенетика» МОСКВА - 2010 Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу «Цитогенетика» для студентов 3 курса факультета биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Авторы: Алиева Ирина Борисовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова. Киреев Игорь Игоревич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова. Курчашова Светлана Юрьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова. Узбеков Рустем Эдуардович, доктор биологических наук, ассоциированный профессор факультета биоинженерии и биоинформатики, МГУ им. М. В.Ломоносова. Под редакцией: доктора биологических наук Узбекова Р.Э., доктора биологических наук, профессора Полякова В.Ю. ©Алиева И.Б., Киреев И.И., Курчашова С.Ю., Узбеков Р.Э. 1 Оглавление. Введение. Место клеточной биологии и ее методических подходов в системе биологических наук.----------- ----------------------------------------------- 2 Глава 1. Методы световой микроскопии ------------------------------------------------ 3 Глава 2. Культивирование клеток in vitro ----------------------------------------------- 13 Глава 3. Прижизненное наблюдение клеток -------------------------------------------- 33 Глава 4. Гистохимическая окраска препаратов для световой микроскопии ---- 46 Глава 5. Иммуноцитохимия --------------------------------------------------------------- 56 Глава 6. Флуоресцентная микроскопия -------------------------------------------------- 72 Глава 7. Электронная микроскопия ------------------------------------------------------- 79 Глава 8. Определение параметров клеточного цикла --------------------------------- 92 Глава 9. Синхронизация клеток в культуре -------------------------------------------- 105 Глава 10. Приготовление хромосомных препаратов и гибридизация in situ ---- 114 Глава 11. Выявление активных ядрышковых организаторов ---------------------- 121 Глава 12. Трансформация клеток ---------------------------------------------------------- 127 2 Введение. Несмотря на то, что первые микроскопы были изобретены еще в 17 веке, планомерное изучение клеток и входящих в их состав органелл получило бурное развитие только во второй половине 19 века. Тогда же появилась наука "Цитология", которая является предшественницей современной науки "Клеточная биология". В отличие от классической цитологии, методологически основанной практически исключительно на микроскопическом анализе специально подготовленных для этого клеток, клеточная биология использует более широкий арсенал методов, включая биохимические, молекулярно-биологические и биофизические. Кроме того, в клеточной биологии широко применяются различные методы электронной микроскопии и иммуноцитохимического анализа. Качественный морфологический анализ дополняется количественным анализом различных внутриклеточных процессов и их математическим моделированием. Основной задачей предлагаемого практического курса является обучение студентов основным методам современной клеточной биологии. В каждом разделе имеется небольшая теоретическая часть, которая знакомит студентов с базовыми сведениями, касающимися выполняемой задачи. В экспериментальной части более детально обсуждаются методические тонкости и сложности, которые могут встретиться в процессе выполнения работы, указываются "Цель работы", "Практическая задача", "Объект исследования", необходимые "Приборы и реактивы" и "Последовательность экспериментальных операций", точно соблюдая которую студент сможет выполнить поставленную задачу. В некоторых главах приведено описание нескольких экспериментальных задач, выбор которых может быть осуществлен в зависимости от возможностей экспериментальной базы. Первая часть практикума (Главы 1-7) знакомит студентов с методами и принципами морфологического анализа. Во второй части представлено несколько задач, в которых уже изученные методы дополняются цитофизиологическими и молекулярно-биологическими методами. В зависимости от учебного плана и времени, отведенного на практикум, часть задач может быть выполнена в демонстрационном режиме, в том числе, на примере реальных научных исследований, проводимых в лаборатории, на базе которой осуществляется выполнение задач практикума. 3 Глава 1. Методы световой микроскопии. 1. Теоретическая часть. Устройство микроскопа. Метод светлого поля. На Рис. 1 приведена принципиальная схема современного оптического микроскопа. Свет непосредственно от источника (1) и от заднего зеркала осветителя направляется в оптическую систему микроскопа. Линзы коллектора (3) обеспечивают формирование центрированного близкого к параллельному светового пучка. При необходимости для уменьшения интенсивности света или для выделения света определенной длины волны могут быть использованы светофильтры (4). Регулировка интенсивности освещения может также производиться изменением уровня накала лампы осветителя. Конденсор (8) фокусирует свет в плоскости объекта, обеспечивая яркое и равномерное освещение. Объект (11) располагается на предметном столике (10), который обеспечивает перемещение объекта для фокусировки и исследования различных зон препарата. Перемещение в плоскости XY осуществляется при помощи коаксиальных ручек, расположенных на предметном столике. Перемещение по оси Z осуществляется при помощи вращения ручек фокусировки, расположенных на станине микроскопа (12, 13). Формирование увеличенного изображения происходит при помощи объектива (14), который имеет фиксированное увеличение, поэтому для проведения исследований в широком диапазоне увеличений современные микроскопы снабжены набором объективов, закрепленных на вращающемся револьвере. Окуляры (16), расположенные на бинокулярной насадке, проецируют увеличенное изображение объекта на сетчатку глаза. Кроме того, часть света (или весь свет) с помощью светоделительной призмы (15) может быть направлен на чувствительный элемент фото- или видеокамеры (17). В оптической схеме микроскопа можно выделить две системы сопряженных плоскостей. Первая включает: нить лампы, диафрагму конденсора (апертурная диафрагма), заднюю фокальную плоскость объектива и диск Рамсдена - маленький (около 3 мм диаметром) светлый кружок, который можно наблюдать, если в нескольких миллиметрах от окуляра расположить лист бумаги. Именно в этой плоскости должен быть расположен зрачок, чтобы весь свет попадал в глаз. 4 Рис. 1. Принципиальная схема расположения основных узлов современного оптического микроскопа: (1) источник света; (2) зеркало осветителя;(3) система коллекторных линз осветителя; (4) светофильтры; (5) полевая диафрагма; (6) набор колец для наблюдения с использованием метода фазового контраста; (7) апертурная диафрагма конденсора; (8) конденсор;(9) ручка фокусировки конденсора; (10) предметный столик; (11) объект; (12) ручка грубой фокусировки; (13) ручка тонкой фокусировки; (14) объективы; (15) светоделительная призма; (16) окуляр; (17) фото- или видеокамера. Для настройки освещения обычно рассматривают заднюю фокальную плоскость объектива, которая видна глазом, если вынуть окуляр. Чтобы задняя фокальная 14 11 1 16 15 17 14 10 8 13 2 3 4 5 12 7 6 9 5 плоскость объектива была видна лучше, ее наблюдают либо с помощью специального маленького микроскопа, который устанавливается на место окуляра, либо с помощью линзы Бертрана, которая находится внутри микроскопа и вводится в оптический путь, когда это необходимо. В последнем случае наблюдение задней фокальной плоскости объектива (и плоскостей, с ней сопряженных) ведется через окуляры. Вторая система сопряженных оптических плоскостей включает в себя диафрагму поля зрения (полевая диафрагма, 5), препарат (11), первичное изображение и сетчатку глаза. Эта система сопряженных плоскостей видна через окуляры (16). Для получения качественного изображения исследуемого объекта необходимо правильное расположение всех компонентов оптической системы вдоль главной оптической оси относительно друг друга. Для того чтобы добиться наилучшего разрешения мелких деталей, препарат должен освещаться максимально широким пучком света. Максимальная интенсивность освещения достигается, если спираль лампы осветителя располагается в плоскости, сопряженной с плоскостью препарата. Такая схема освещения носит название критического освещения. Однако в этом случае освещение препарата оказывается неравномерным. Этот недостаток может частично компенсироваться использованием ламп со спиралью специальной формы и матового светофильтра, но существует и другая возможность добиться равномерности освещения – использование схемы освещения, разработанной Августом Кёллером (1866-1948). При настройке света по Кёллеру изображение спирали, создаваемое коллекторными линзами осветителя, находится не в плоскости препарата, а в плоскости апертурной диафрагмы конденсора. В этом случае каждая точка изображения нити лампы равномерно освещает каждую точку объекта. Метод фазового контраста. Как правило, для микроскопического анализа используются препараты, окрашенные специальными красителями. В этом случае контраст изображения создается за счет поглощения красителями части падающего на клетки света. Такие объекты носят название амплитудных объектов, так как они создают разницу амплитуд падающей световой волны в разных частях изображения, что воспринимается глазом как разница в интенсивности освещения. В тоже время, для решения некоторых специальных задач необходим микроскопический анализ неокрашенных («прозрачных») объектов. Неокрашенные 6 биологические объекты, плохо поглощают свет, поэтому, если микроскоп настроен правильно, при изучении в светлом поле разглядеть какие-либо структуры удается с большим трудом. Разработано много методов, которые позволяют усилить контраст прозрачных объектов – дифференциально-интерференционный контраст, косое освещение, Хоффмановский контраст и другие. Но наиболее часто для решения такого рода задач используется метод фазово-контрастной микроскопии, основанный на преобразовании разности фаз в разницу амплитуд. Известно, что при прохождении через прозрачные не окрашенные образцы свет частично дифрагирует (рассеивается), причем, диффрагировавший свет имеет небольшой сдвиг по фазе относительно недифрагировавшей волны. Такие объекты носят название фазовых объектов. При прохождении света через фазовый объект падающая световая волна делится на две составляющие: недиффрагировавший свет (S-волна), который проходит через объект, но не взаимодействует с ним, и диффрагировавший свет (D- волна), который рассеивается объектом из-за различий в показателе преломления (n) среды (n 0 ) и объекта (n 1 ). Если n 1 >n 0 , D-волна испытает некоторое запаздывание по фазе, по сравнению с S-волной, и наоборот. Величина этого фазового сдвига пропорциональна n 0 -n 1 . Для биологических объектов этот сдвиг составляет около ¼ длины волны. Поскольку показатель преломления и сдвиг по фазе зависят от длины волны λ, S- и D-волна собираются объективом и фокусируются в плоскости первичного изображения, где в результате их интерференции формируется изображение объекта. В связи с тем, что только незначительная часть света подвергается диффракции, проходя через прозрачные биологические объекты, амплитуда D-волны мала по сравнению с амплитудой S-волны. Поэтому Р-волна, образующаяся в результате интерференции S- и D-волны, незначительно отличается по амплитуде от S-волны и сдвинута по фазе примерно на 1/20λ. Для увеличения вклада D-волны в формирующееся изображение и получения видимого изменения яркости между объектом и фоном, необходимо уменьшить амплитуду S-волны и дополнительно увеличить сдвиг по фазе таким образом, чтобы он составлял примерно ½ λ. Это достигается введением в оптический путь двух элементов: кольцевой диафрагмы конденсора и фазовой пластинки, располагающейся в задней фокальной плоскости объектива (Рис. 2). Фазовая пластинка содержит фазовое кольцо — небольшое кольцевое углубление, глубина которого 8 Препарат освещается через кольцевую диафрагму конденсора, и нерассеянный препаратом свет (S-волна) проходит через фазовое кольцо, где его амплитуда уменьшается и происходит ускорение на ¼ λ. Рассеянный на объекте свет (D-волна) отклоняется от первоначального пути и проходит через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо. Таким образом, S- и D-волны становятся близкими по амплитуде и находятся в противофазе (1/4λ+1/4λ). В результате их интерференции в плоскости первичного изображения фазовые объекты выглядят темнее фона и становятся визуально различимыми. Однако, поскольку величина фазового сдвига зависит не только от n, но и от толщины объекта, в очень толстых объектах может происходить значительное замедление D-волны (1/2 λ). В этом случае фазовые объекты будут выглядеть светлее фона в результате конструктивной интерференции. 2. Экспериментальная часть. Практическая работа №1. Настройка освещения по Келеру. Цель работы: овладение навыками правильной работы на световом микроскопе. Объект исследования: клеточная линия СПЭВ (эмбриональный почечный эпителий). Приборы и реактивы: микроскоп, препарат зафиксированных и окрашенных клеток. Последовательность экспериментальных операций: 1. Включить освещение микроскопа и проверить центровку лампы. Для этого достаточно расположить сразу под конденсором (в случае «прямого» микроскопа) лист бумаги, на котором будет видно изображение нити лампы. Иногда внутри домика лампы устанавливается дополнительное зеркало (Рис. 1 – 2), которое позволяет добиться более яркого освещения. В этом случае в качестве источника света служит не только сама спираль лампы, но еще и ее изображение, отраженное зеркалом. 2. Сфокусировать микроскоп на препарат с использованием объектива ×10. 3. Сфокусировать изображение полевой диафрагмы и отрегулировать ее диаметр. Как уже было отмечено, полевая диафрагма должна находиться в плоскости, сопряженной с плоскостью изображения, а значит, ее изображение должно быть четко видно при наблюдении препарата через окуляры. Глядя в окуляры, необходимо закрыть полевую диафрагму. Изображение диафрагмы может быть не сцентровано и может быть сильно дефокусировано (т.е. иметь нечеткие края). Диафрагму следует 9 сфокусировать, перемещая конденсор вверх или вниз. Чтобы контуры диафрагмы были лучше видны, на этом этапе следует закрыть еще и апертурную диафрагму конденсора (Рис. 1 – 7). Затем необходимо отцентровать изображение диафрагмы с помощью центровочных винтов конденсора. Проще всего это сделать, если раскрыть полевую диафрагму таким образом, чтобы ее границы приблизились к краю поля зрения. Таким образом, изображение полевой диафрагмы сцентровано и размещено в плоскости, сопряженной с плоскостью изучаемого препарата. Теперь диафрагму раскрывают так, чтобы ее границы были вне видимого в окуляры поля зрения. Важно понимать, что изображение диафрагмы должно только немного выходить за пределы поля зрения. Излишне освещая изображение вне поля зрения, можно снизить контрастность (и разрешение) изображения, так как рассеянный (диффрагировавший) свет от освещенной, но невидимой через окуляры части препарата, будет влиять на все изображение. Если препарат предполагается фотографировать, то изображение полевой диафрагмы следует развести таким образом, чтобы было освещено не все видимое через окуляры поле зрение, а только та его часть, которая будет сфотографирована. В данном случае оправа матрицы цифровой камеры выступает в роли диафрагмы поля зрения. Надо учитывать, что при использовании объективов с небольшим увеличением (×5-×10), диаметр полевой диафрагмы может оказаться недостаточно большим, чтобы полностью заполнить все поле зрения. Если предполагается работать с такими объективами, то следует выбирать конденсор с откидывающейся верхней линзой. Такая линза может быть выведена из оптического пути, при этом увеличивается фокусное расстояние конденсора и размер изображения полевой диафрагмы. В большинстве случаев после выведения верхней откидывающейся линзы из оптического пути, конденсор должен быть вновь сфокусирован. 4. Раскрыть апертурную диафрагму конденсора. В большинстве микроскопов нет необходимости центровать апертурную диафрагму, хотя в ряде конденсоров имеются приспособления для ее центровки. Но сначала надо увидеть изображение этой диафрагмы. Апертурная диафрагма конденсора находится в плоскости, сопряженной с задней фокальной плоскостью объектива, которую можно наблюдать, заменив один из окуляров на специальный микроскоп, либо введя в оптический путь линзу Бертрана. 10 При полностью закрытой апертурной диафрагме конденсора изображение выглядит контрастным, но мелкие детали не разрешаются. Постепенно раскрывая диафрагму можно наблюдать, как контраст изображения уменьшается, при этом становятся различимы все более тонкие детали. Следует отметить, что если числовая апертура конденсора больше, чем числовая апертура объектива, часть света будет проходить мимо объектива, не участвуя в формировании изображения. Часть этого лишнего света будет рассеиваться (дифрагировать) в препарате и частично попадать в объектив, что приведет к снижению контрастности изображения и уменьшению разрешения. Поэтому для получения оптимального результата диафрагму конденсора необходимо раскрыть таким образом, чтобы ее изображение занимало примерно 70 - 80% площади задней фокальной плоскости объектива. Если, например, используется объектив с числовой апертурой 1.3 и конденсор с числовой апертурой 0.95, следует раскрыть апертурную диафрагму конденсора полностью. Яркость освещения может быть отрегулирована изменением накала лампы или использованием дополнительных светофильтров. Практическая работа №2. Настройка фазового контраста. Цель работы: овладение навыками настройки фазового контраста. Объект исследования: клеточная линия СПЭВ (эмбриональный почечный эпителий). Приборы и реактивы: микроскоп, оснащенный оптической системой для наблюдения клеток методом фазового констаста, препарат фиксированных неокрашенных клеток. Для наблюдения методом фазового контраста необходимы: специальный конденсор и специальные объективы. Конденсор для фазового контраста содержит набор из нескольких кольцевых диафрагм, соответствующих различным объективам. Фазовые объективы отличаются от обычных тем, что в задней фокальной плоскости у них нанесено фазовое кольцо (либо на специальной фазовой пластинке, либо на последней линзе). На корпусе такого объектива имеется маркировка Ph и номер, который указывает размер фазового кольца. Фазовые кольца разных объективов могут иметь одинаковую апертуру. Поэтому и на объективах и на конденсоре фазовые кольца маркируются не увеличением объектива, а условными номерами: Ph1, Ph2, Ph3. Как 11 правило, кольцевая диафрагма Ph1 соответствует объективам с увеличением ×5-×10, Ph2 – объективам ×16-×40 (сухие системы) и Ph3 - иммерсионным объективам ×40- ×100. Для настройки фазового контраста необходимо, чтобы номера кольцевой диафрагмы конденсора и фазового кольца объектива совпадали. Для установки света по методу фазового контраста кроме специальных объективов и конденсора необходим вспомогательный микроскоп, который обычно входит в комплект фазово-контрастного устройства. Иногда внутри микроскопа устанавливается специальная линза Бертрана, которую можно ввести в оптический путь микроскопа, что позволяет изучать заднюю фокальную плоскость объектива непосредственно через окуляры. Последовательность экспериментальных операций: 1) Убедиться, что все необходимые элементы имеются в микроскопе (выбранный объектив должен иметь фазовое кольцо, конденсор - револьвер и в нем соответствующую объективу фазовую диафрагму). 2) Установить препарат на столик микроскопа и конденсор в режиме светлого поля. Поскольку препарат неокрашен, то для наведения на фокус может понадобиться закрыть апертурную диафрагму конденсора (чтобы увеличить контраст). Не следует пользоваться интенсивно окрашенным препаратом (например, окраска гематоксилин- эозином или азур-эозином). В этом случае фазовый эффект довольно трудно наблюдать, так как он будет налагаться на светлопольное изображение. 3) Установить в микроскопе свет по Келеру (апертурную диафрагму можно не настраивать, так как она будет затем заменена на фазовое кольцо). Изображение препарата станет практически невидимым. 4) Вынуть один окуляр, и установить вместо него вспомогательный микроскоп (или ввеcти в оптический путь линзу Бертрана). Сфокусировать вспомогательный микроскоп на заднюю фокальную плоскость объектива. При правильной установке на светлом поле будет четко видна серая кольцевая пластинка – фазовое кольцо объектива. 5) Ввести в ход лучей в конденсоре кольцевую (фазовую) диафрагму, соответствующую выбранному объективу. При этом, контраст изображения существенно увеличится. В поле зрения вспомогательного микроскопа диафрагма конденсора будет иметь вид яркого светлого кольца. Если свет установлен правильно, 12 то светлое и темное кольца в поле зрения будут иметь приблизительно одинаковый диаметр. Они располагаются, как правило, слегка эксцентрично. Если изображение светлого кольца нерезкое, то его следует сделать максимально резким, слегка перемещая конденсор. 6) Совместить два изображения юстировочными винтами фазового кольца конденсора. Светлое кольцо (конденсора) должно расположиться полностью внутри темного кольца (фазовая пластинка в задней фокальной плоскости объектива). Для совмещения колец нельзя пользоваться центровочными винтами конденсора – это приведет к нарушению установки света. 7) Заменить вспомогательный микроскоп на окуляр и приступить к наблюдениям. Важно! Настройка фазового контраста выполняется независимо для каждого объектива микроскопа и для каждого препарата, если их оптическая толщина различается. Метод фазового контраста очень чувствителен к чистоте предметного и покровного стекол, а также фронтальной поверхности линзы конденсора. Даже незначительное загрязнение покровного стекла способно свести к минимуму фазовый эффект от препарата. С другой стороны, учитывая сравнительно небольшую апертуру фазового кольца, для получения фазового контраста даже для иммерсионных объективов возможно применение конденсоров с меньшей апертурой, чем для светлого поля. Соответственно такие конденсоры могут иметь больший рабочий отрезок и позволяют работать со значительно более толстыми препаратами. Поскольку оптимальные условия наблюдения фазового контраста соответствуют применению зеленого света, то требования к хроматической коррекции объективов невелики – даже меньше, чем при микроскопии в светлом поле. Поэтому для наблюдения клеток методом фазового контраста можно с успехом использовать любые типы объективов. 13 | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
Рис. 2. Формирование изображения в фазово-контрастном микроскопе: в отсутствии
(А) и в присутствии объекта (Б). ©Рисунок предоставлен Голышевым С.А.
7
