пренатальная диагностика. Пренатальная диагностика хромосомных болезней
 Скачать 0.5 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
Молекулярный скрининг Молекулярный скрининг представляет собой часть обширной программы скрининга наследственной патологии, которая встречается у 1 % всех новорожденных. Скринирующие программы ДНК-диагностики используются для выявления досимптоматических больных и бессимптомных гетерозиготных носителей наиболее частых моногенных болезней. Выявление гетерозиготного носительства с точной идентификацией мутации в случае аутосомно-рецессивных заболеваний или заболеваний, сцепленных с Х-хромосомой, принципиально важно для определения информативности семьи, то есть возможности проведения ПД. Реально такие программы применимы только к тем моногенным болезням, для которых можно идентифицировать не менее 90% мутаций. В России пока доступны идентификации только около 65-70% случаев мутаций гена муковисцидоза, что явно недостаточно для внедрения скринирующих программ ДНК-диагностики. Однако уточнение диагноза у больного ребенка и последующее обследование членов семьи представляет собой вариант селективного скрининга в группах высокого риска. ДНК-скрининг наиболее частых (мажорных) мутаций самых распространенных моногенных болезней (муковисцидоз, фенилке-тонурия, миодистрофия Дюшенна, гемофилия А и В, спинальная мышечная амиотрофия Верднига-Гоффмана, адреногенитальный синдром и др.) может проводиться не только в семьях высокого риска, но и по желанию супругов при составлении «Генетической карты репродуктивного здоровья». Иммунологический скрининг Иммунологический скрининг включает тестирование Rh-принадлежности матери и ряда инфекций, потенциально нарушающих внутриутробное развитие плода. Rh-конфликтная беременность — одна из серьезных проблем современного акушерства. Возникающая вследствие такого конфликта гемолитическая болезнь — грозное осложнение беременности, которое можно предотвратить при соблюдении двух следующих условий: своевременное определение Rh-принадлежности беременной (супругов) и при отрицательной резус-принадлежности крови беременной — определение наличия антирезусных антител в ее крови. При необходимости инвазивной пренатальной диагностики хромосомной патологии плода у резус-отрицательной женщины вопрос о выборе оптимального срока беременности для проведения манипуляции решается индивидуально с учетом ее акушерского анамнеза, степени выраженности гемолитической болезни плода при предыдущей беременности и наличия титра антител к Rh-фактору. Разработан и алгоритм обследования и проведения инвазивной ПД наследственных болезней у беременных с Rh-отрицательной принадлежностью. Опасность для плода представляют и ряд инфекций. К таковым относятся: вирус краснухи, простого герпеса, цитомегаловирус, вирус ветряной оспы, возбудители токсоплазмоза. Присутствие IgG-антител при отсутствии IgM-антител указывает на то, что женщина переболела данным заболеванием до беременности. Высокие титры IgG-антител при наличии IgM-антител указывают на текущую инфекцию. Применение современных молекулярных тест-систем для детекции возбудителей перечисленных инфекций методом ПЦР в сочетании с классическими серологическими и бактериологическими методами позволяет достаточно надежно проводить иммунологический скрининг не только на ранних сроках беременности, но и в преконцепционном периоде. Показания для направления на инвазивную пренатальную диагностику В соответствии с принципами формирования групп риска, основные показания к инвазивной пренатальной диагностике с целью кариотипирования плода можно подразделить на две категории. Первая категория включает группы, формируемые по результатам обследования плода неинвазивными методами пренатальной диагностики (ультразвуковые и биохимические маркеры хромосомных болезней). Вторая категория формируется при цитогенетическом скрининге и включает группы, в которых хромосомные аберрации либо наследуются, либо возникают с повышенной частотой denovo. Группы риска для инвазивной ПД формируются по результатам скринирующих программ, а также на основании медико-генетического консультирования . Стандартные показания для направления на консультацию для определения целесообразности проведения инвазивной ПД, одобренные ВОЗ, включают: • возраст женщины старше 35 лет; • наличие не менее двух самопроизвольных абортов на ранних сроках беременности; • наличие в семье ребенка или выявление при предыдущей беременности плода с болезнью Дауна и другими хромосомными болезнями; • наличие в анамнезе ребенка с множественными врожденными пороками; • семейное носительство хромосомных перестроек; • моногенные заболевания, ранее диагностированные в семье или у ближайших родственников; • облучение кого-нибудь из супругов или применение до зачатия ряда фармакологических препаратов (цитостатиков, антиэпилептических лекарств, некоторых антибиотиков, противоопухолевых препаратов и др.); • высокий риск рождения ребенка с хромосомной болезнью по результатам биохимического скрининга; • пороки или отклонения развития, выявленные при ультразвуковом исследовании. Важно отметить, что спектр показаний и объем инвазивной ПД для каждого центра ПД определяется его диагностическими возможностями и штатным расписанием. Инвазивные методы получения плодного материала Инвазивными (оперативными) методами ПД называются внутрима-точные вмешательства под ультразвуковым контролем, выполняемые с целью получения плодного материала для последующих гистологических, биохимических, цитогенетических или молекулярных анализов. Зародыш человека доступен для исследований, а следовательно, и для диагностики, практически на любой стадии развития (рис. 4) Основными инвазивными методами являются методы микрургии, позволяющие удалять полярные тельца или отдельные бластомеры у доимплантационных зародышей; после имплантации— это трансабдоминальная (или трансвагинальная) хорионбиопсия, реже — ранний амниоцентез; во II триместре беременности — плацентобиопсия, амниоцентез и кордоцентез (пункция пуповины с целью забора крови плода). В III триместре обычно используют кордоцентез. Выбор инвазивного метода определяется сроком беременности, показаниями к его проведению, инструментальной и методической оснащенностью центра ПД, а также квалификацией акушера-оператора. Последнее обстоятельство особенно существенно отражается на ранних послеоперационных осложнениях, под которыми понимают угрожающие состояния, вплоть до самопроизвольного прерывания беременности в течение 7-14 дней после операции. Рис.4. Инвазивные методы пренатальной диагностики  Специальные лабораторные методы исследования плодного материала (бластомеров, ворсинок хориона, амниоцитов или лимфоцитов плода) могут быть различны, зависят от целей и сроков ПД. Наиболее универсальными являются методы молекулярной (ДНК) диагностики и методы цитогенетического анализа. Принципы и методы диагностики хромосомных болезней В настоящее время проблема цитогенетической ПД на любом сроке беременности практически решена. Разработаны надежные и эффективные методы хромосомного анализа клеток плода и зародышевых оболочек. В зависимости от срока беременности и задач исследования материалом для хромосомного анализа могут служить клетки амниотической жидкости, хориона, плаценты и лимфоциты пуповин-ной крови плода, полученные тем или иным инвазивным способом . Все эти клетки, как установлено, имеют плодное происхождение и по своим генотипическим характеристикам соответствуют клеткам самого плода. В нашем центре наиболее часто используются клетки хориона (I триместр) или клетки плаценты (II триместр), полученные с помощью трансабдоминальной хорионбиопсии или плацен-тобиопсии. Хромосомные препараты из тканей хориона или плаценты готовят прямым методом. Преимущества и недостатки цитогенетического анализа при использовании разных методов получения хромосомных препаратов из образцов плодного материала суммированы в таблице 9.7. Использование в большинстве центров комплекса цитогенетических и молеку-лярно-цитогенетических методов диагностики позволяет получить наиболее полную информацию о кариотипе плода на различных стадиях внутриутробного развития. Таблица 4. Характеристика методов получения препаратов хромосом для стандартного кариотипирования плода
Особенности цитогенетического анализа клеток различного плодного происхождения Клетки амниотической жидкости Клетки амниотической жидкости (КАЖ) представлены несколькими типами различного происхождения: • клетки амниотической оболочки (собственно амниоциты); • эпителиальные клетки плода (эпидермиса, пищеварительного тракта, мочеполовых и дыхательных путей, слизистой ротовой полости). Количественный и качественный состав КАЖ, а также концентрация жизнеспособных клеток имеют индивидуальную вариабельность и зависят от стадии развития. Оптимальными для ПД являются амниоциты, которые обычно активно пролиферируют и являются специфическими для данной культуры. Наиболее часто для культивирования используют амниотические клетки, полученные в срок 15-18 недель беременности. Использование для этих целей амниоцитов более ранних (12-14 недель беременности) или более поздних (после 20-й недели беременности) сроков принципиально возможно, но, как правило, резко осложняет и удлиняет процесс диагностики. Стандартное культивирование амниоцитов с момента получения образца АЖ до кариотипирования занимает 14-21 день. К недостаткам можно отнести высокую стоимость культуральных питательных сред и оборудования, что немаловажно для отечественных лабораторий, а также высокую (до 2 %) вероятность контаминации образца клетками материнского происхождения. Клетки ворсин хориона (плаценты) Клетки ворсинчатого хориона (плаценты), доступные для ПД, имеют различное происхождение: • клетки цитотрофобласта (дифференцируются на стадии морулы); • клетки мезенхимы (дифференцируются на стадии бластоцисты). Для хромосомного анализа по клеткам хориона или плаценты используют два основных метода. 1. Длительное культивирование: растущие в монослое первичные культуры имеют гетерогенный клеточный состав с преимущественным ростом фибробластоподобных клеток мезенхимальной стромы ворсин. Образование колоний или рыхлого монослоя происходит обычно к 10-12 дню культивирования. Основными недостатками метода являются длительность культивирования и контаминация культур материнскими клетками. 2. «Прямые» препараты. Метод анализа «прямых» препаратов базируется на исследовании спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта без их предварительного культивирования в сроки от 10 до 20 недель беременности. Разработаны модификации прямого метода — метод «стряхивания — отпечатывания» и ускоренный прямой метод, которые позволяют получать препараты из хориона/плаценты, удовлетворяющие всем критериям кариотипирования. В сочетании с флуоресцентными методами дифференциальной окраски хромосом результативность этих методов превышает 99 %. Следует подчеркнуть, что эти модификации пригодны для приготовления препаратов хромосом из тканей с высокой естественной ми-тотической активностью, включая любые ткани и органы зародыша. Интерфазные ядра, обработанные таким способом, вполне пригодны для метода FISH со специфическими ДНК-зондами, что важно при верификации онтогенетического пренатального диагноза. Лимфоциты пуповинной крови плода Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную методику стимулирования лимфоцитов фитогемагтлютинином (ФГА). Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосомном статусе плода и настоятельно рекомендуется для кариотипирова-ния плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при наличии пороков развития не только во II, но как показывает наш опыт и в III триместре беременности. В последнем случае кариотипирова-ние плода позволяет разрешить вопрос о тактике ведения беременности, родов и неонатального периода. Основные принципы цитогенетического анализа в пренатальной диагностике При пренатальном кариотипировании следует руководствоваться рекомендациями, принятыми в отечественной и международной клинической цитогенетике, а также нормативными документами МЗ РФ (Приказ МЗ РФ № 316 от 30.12.1993). Заключение о кариотипе должно соответствовать правилам Международной номенклатуры хромосом. Программы контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы включают состав и квалификацию персонала, оборудование и реактивы, а также ряд параметров, касающихся непосредственного выполнения хромосомного анализа. В связи с увеличением числа центров ПД, а также отсутствием единой системы контроля качества, представляется целесообразным рассмотреть основные требования к организации работы цитогенетических подразделений, обратив особое внимание на критерии качества пренатального кариотипирования. Состав и квалификация персонала Согласно нормативам (Приказ МЗ РФ № 316 от 30.12.1993), цитогенетическая пренатальная диагностика осуществляется коллективом, состоящим из специалистов с высшим и средним специальным образованием. При этом штатная структура цитогенетического подразделения должна иметь не менее двух ставок врачей-цитогенетиков и соответствующее им число ставок фельдшеров-лаборантов. При этом каждый врач-цитогенетик должен выполнить 160 пренатальных кариотипов в год. Оборудование Необходимым условием точности проводимых исследований является соответствующее им лабораторное оборудование, контроль и сертификация которого осуществляются по определенной схеме. Реактивы Следует особо подчеркнуть, что необходимо заблаговременно проверять качество всех реактивов, используемых для приготовления рабочих растворов. Во избежание повторных технических ошибок рекомендуется учитывать и анализировать их характер и частоту в режиме лабораторной базы ошибок. Показатели качества цитогенетических исследований Число анализируемых метафаз. Для препаратов из культур клеток достаточным считается наличие 20-50 метафазных пластинок на предметное стекло. Качество «прямых» препаратов из цитотрофо-бласта хориона или плаценты, как отмечалось выше, можно считать удовлетворительным, если на стекле присутствует более 10 метафаз, пригодных для подсчета и анализа структуры хромосом. При этом независимо от способа приготовления препаратов разброс хромосом признается хорошим, если наложения хромосом отсутствуют или представлены небольшим числом (1-2) в более 80 % пластинок, и плохим, если многочисленные наложения хромосом встречаются более чем в 20 % метафаз. Качество окраски. Для ориентировочной оценки уровня разрешения рекомендуется произвести подсчет числа G-сегментов в хромосомах 1 и 2 с умножением полученной суммы на 6. Качество окраски признается хорошим, если ее четкость при уровне разрешения 550 сегментов позволяет идентифицировать четыре G-сегмента на 18q и 3 — на 11p, 7q33 и 7q35, особенно если удается визуализировать сегмент 22ql3.2. Такой уровень (400-550 сегментов на гаплоидный набор) достаточен для стандартного кариотипирования. Для анализа микроперестроек хромосом требуется более высокое разрешение (> 800 сегментов), которое достигается при использовании репликационных вариантов дифференциального окрашивания. Время анализа. Промежуток времени от момента получения плодного материала до постановки цитогенетического диагноза зависит от методических особенностей выполняемого исследования, пропускной способности лаборатории, диагностической сложности конкретного случая, необходимости уточняющих лабораторных мероприятий и т. д. Оптимальным для кариотипирования по клеткам ворсин хориона является срок 3-7 дней, клеток амниотической жидкости— 10-16 дней, лимфоцитов пуповинной крови— 4-7 дней. Большую часть времени составляет этап культивирования, тогда как собственно анализ хромосомных препаратов в стандартном режиме занимает 1-1,5 рабочих дня. Однако реальные сроки цитогенетической диагностики могут варьировать в широком диапазоне Так, высокотехнологичный и продуктивный метод FISH позволяет проводить анализ по интерфазным ядрам на препаратах некультивированных клеток за 1-2 дня. Этот метод широко используется за рубежом для экспресс-диагностики наиболее распространенных анеуплоидий. Увеличение времени анализа, оптимального для каждого метода, обусловлено либо техническими, либо диагностическими проблемами. К техническим проблемам можно отнести низкий митотический индекс и неудовлетворительное качество метафазных пластинок, что требует просмотра всех полученных препаратов. Возможные неудачи при цитогенетическом исследовании обусловлены, как правило, отсутствием метафазных пластинок, пригодных для анализа. Средние стандарты технических (неполучение результата при наличии жизнеспособных клеток) и культуральных (отсутствие адекватного роста клеток) неудач при кариотипировании по клеткам амниотической жидкости и хориона составляют 1,5 и 2 % соответственно, а по лимфоцитам периферической крови— 5%. Накопленный нами опыт (более 8000 пренатальных диагностик) показывает, что результативность анализа по клеткам цитотрофобласта на «прямых» препаратах из хориона и плаценты, а также по ФГА-стимулированным лимфоцитам пуповинной крови оказывается выше (в среднем 99,8 %). Причины невозможности проведения цитогенетического анализа в 0,2-0,4 % случаев были рассмотрены нами в соответствующих разделах. Вместе с тем, отсутствие или недостаточное число метафаз на «прямых» препаратах далеко не всегда связано с нехваткой материала, полученного при хорион- или плацентобиопсии. Однако вес образца должен составлять > 10 мг для ускоренного метода и > 15 мг для кратковременных культур, а в случае совмещения прямых методов с культивированием клеток в монослое — > 30 мг. Диагностическим проблемам и способам их решения посвящен специальный раздел этой главы. Отметим только, что сложные случаи требуют не только применения дополнительных методик для уточнения первичного цитогенетического заключения, но и кариотипирования родителей, что задерживает постановку цитогенетического диагноза как минимум на неделю.  перейти в каталог файлов | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |