Общая_микробиологи_учеб._пособие. Учебно-методическое пособие Новосибирск 2016
 Скачать 1.43 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
| Тема 1. Методы стерилизации План 1. Понятие о стерильности. 2. Споры и их строение. 3. Техника окраски спору бацилл - окраска по Ожешко; - окраска по Пешкову. 4. Подготовка посуды к стерилизации. 5. Методы стерилизации - физические методы - химические методы - механические методы 6. Одноразовая стерильная посуда. 1. Понятие о стерильности В работе микробиолог должениметь дело с одним определенным видом микроорганизмов, избавившись от посторонней микрофлоры. Достичь этого можно лишь в том случае, когда посуда, питательные среды,инстру- менты, используемые микробиологом, будут стерильны. Стерилизация, или обеспложивание (лат. sterilis – бесплодный, – это полное уничтожение микроорганизмов и их спор в стерилизуемом объекте. Разработаны специальные методы стерилизации, которые применяются не только в микробиологии, но ив медицине, ветеринарии, пищевой и консервной промышленности. Обычные (вегетативные) формы бактерий погибают при использовании того или иного метода стерилизации сравнительно быстро, в то время как споры более устойчивы к высокой температуре, воздействию кислот, щелочей. Образовывать споры могут многие виды палочковидных бактерий, в том числе возбудители наиболее опасных заболеваний человека и животных. Поэтому особенно важно научиться избавляться от бациллярных спор. Споры и их строение Спора – это своеобразная форма существования бактерий, стадия покоя, позволяющая ей перенести любые неблагоприятные внешние условия. Водной бактериальной клетке может образоваться лишь одна спора, поэтому онане является способом размножения. Спорообразование начинается с концентрации наследственного материала клетки, ее ДНК водном участке и сопровождается уплотнением цитоплазмы вокруг этого участка. Постепенно уплотнения формируют внутренние (интина) и наружные (экзина) многослойные оболочки споры, а вегетативная часть клетки после формирования зрелой споры отмирает и разрушается. Споры в связи с особенностями физико-химического состава их оболочек (большое содержание липидов, солей кальция, магния, калия, фосфора) непроницаемы для воды и растворенных в ней компонентов, устойчивы к действию различныххимических веществ, выдерживают кипячение в течение нескольких часов, во внешней среде (почве, воде, остатках растений, в останках животных) могут сохраняться десятки лет. Размер, форма и положение споры в клетке являются характерными для каждого вида бактерий. Например, диаметр споры может быть больше диаметра самой бактерии, в таком случае стенка бактерии растягивается, и клетка приобретает вид веретена, если спора расположена в центре клетки, или барабанной палочки, если спора расположена на конце бактерии. Эти спорообразующие бактерии относятся в основном к роду С, например, С butiricym – возбудитель маслянокислого брожения, С tetani –- возбудитель столбняка животных, человека, С pectinovorum – возбудитель брожения пектиновых веществ и др. рис. 16). Рис. Схематическое изображение строения споры 1 – экзоспориум; 2 – слои споровой оболочки 3 – внешняя мембрана споры 4 – кора 5 – внутренняя мембрана споры 6 – сердцевина В тех случаях, когда диаметр споры меньше или равен диаметру вегетативной клетки, бактерия при спорообразовании не меняет форму. Такие спорообразующие бактерии относятся к роду Bacillus. Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы животных и человека Bacillus subtilis – сенная палочка. Попав в благоприятные условия, споры быстро прорастают. Молодая вегетативная клетка покидает оболочку споры и начинает свою обычную для бактерии жизнь. Поверхность наружной оболочки спору аэробных бактерий либо гладкая, либо с выростами, выступами и почками. Оболочка составляет значительную часть споры. Основными ее компонентами являются белки (60- 90%) и липиды. Состав аминокислот в белках оболочки неодинаков у бактериальных спор разных видов, однако большая часть цистина, содержащегося в значительном количестве в спорах, обнаруживается именно в оболочке. Подоболочкой располагается кора споры (см. рис. 16), состоящая в основном из муреина, который является нерастворимым структурным материалом коры. Споры более устойчивы, чем вегетативные клетки, от которых они образовались, к воздействию проникающей радиации, ультразвука, гидростатического давления, замораживания, разрежения и др. Устойчивость спор к кислотами щелочам во многом зависит от их принадлежности к различным видам бактерий. Споры некоторых культур бактерий остаются жизнеспособными даже при кипячении в концентрированной соляной кислоте в течение 20 мин. При этом резистентность спор во много раз повышается при их обезвоживании. Техника окраски спору бацилл Сущность метода окрашивания спор по Ожешко Ввиду слабой проницаемости многослойных оболочек спор они не прокрашиваются при обычном методе окраске мазка и выглядят светлыми или овальными включениями, лежащими подоболочкой окрашенной вегетативной части бактерий. Для окраски самих спор препарат необходимо обрабатывать сильнодействующими красящими растворами и протравами стем, чтобы изменить структуру оболочек. Разработано несколько методов окраски спор, наиболее употребительным из которых является метод, предложенный Ожешко. Сущность метода заключается в следующем сначала споры протравливают кислотой, чтобыихоболочки стали более рыхлыми и проницаемыми для красителя. Затем препарат окрашивают, при этом красятся не только споры, но и вегетативные части клеток. Поскольку применяют красную краску – карболовый фуксин Циля (фуксин основной – 1 г, фенол – 5 г, спирт й – 10 мл, глицерин – 3 капли, вода – 100 мл, то и спора, и вегетативная часть станут после окрашивания красными. Это затрудняет исследование, так как споры и вегетативная часть клетки будут выглядеть под микроскопом одинаково. Поэтому повторным воздействием кислотой обесцвечивают препарат. При этом обесцвечиванию подвергается лишь вегетативная часть клетки, а спора останется красной. Обесцвеченную цитоплазму бактерии докрашивают метиленовой синью Леффлера (спиртовый раствор метиленового синего. В таком препарате видны рубиново-красные споры на фоне голубых вегетативных клеток. Техника окраски препарата по Ожешко: 1. Препаратиз культуры споровых микроорганизмов готовятна предметном стекле обычным способом. 2. На мазок наносят пипеткой й раствор серной кислоты на 4 мин. 3. Препарат промывают водой. 4. Наносят на препарат полоску фильтровальной бумаги, пропитанной карболовым фуксином Циля. 5. На полоску наливают несколько капель воды. 6. Берут предметное стекло пинцетом и подогревают препарат над пламенем спиртовки до появления паров (не до кипения, затем отводят препарат в сторону, добавляют несколько капель воды и вновь подогревают, эту процедуру продолжают в течение 4 мин. 39 7. Краску смывают водой. 8. Препарат обрабатывают в течение 2 см раствором серной кислоты. 9. Промывают препарат после кислоты водой. 10. Наносят несколько капель метиленовой сини на 4 мин. 11. Краску смывают. 12. Препарат высушивают между листами фильтровальной бумаги. 13. Препарат микроскопируют с иммерсионным объективом. Споры выглядят рубиново-красными, а вегетативные клетки – голубыми. Сущность метода окрашивания спор по Пешкову Кроме окраски п по методу Ожешко, часто используют окраску спор по Пешкову, который технически проще. Н требуется отдельная двукратная обработка препарата кислотой, как в методе Ожешко. По Пешкову используют синь Леффлера, имеющуюв своем состава щёлочь, и поэтому при нагревании препарата над пламенем щелочная краска легко проникает в споры и окрашиваетих. Промывание водой удаляет краску из вегетативных клеток. Они становятся бесцветными, их необходимо докрашивать, в частности, нейтральным красным. Техника окраски спор по Пешкову: 1. На фиксированный мазок наливают щелочную синь Леффлера и осторожно нагревают над пламенем спиртовки до закипания (примерно 20 с. 2. Препарату дают остыть и промывают водой. З. Докрашивают м водным раствором нейтрального красного, наливая его на мазок (30 с. 4. Препарат промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги. 5. Споры окрашиваются в голубой цвет, вегетативные клетки – в красный. Препарат микроскопируют с иммерсией. 4. Подготовка посуды к стерилизации Для того, чтобы избавиться от посторонних микроорганизмов и их спор, посуда, используемая в микробиологическом практикуме, должна быть стерильной. Стерилизовать можно только абсолютно чистую, специально подготовленную посуду. Грязную посуду обрабатывают 30-40 мин хромовой смесью (серная кислота с бихроматом калия, являющейся сильным окислителем и хорошо очищающей стекло от органических остатков. После пребывания в смеси посуду прополаскивают проточной водой и промывают мылом с помощью ерша или щетки. Если посуда сильно загрязнена, ее перед мытьем кипятят 10-15 мин в растворе мыла. Вымытую посуду хорошо ополаскивают водой и сушат на воздухе. Совершенно сухую посуду заворачивают в оберточную бумагу, а пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. 40 Пипетки. В верхний конец пипетки вкладывают небольшой кусочек ваты, чтобы избежать попадания растворов, набираемых пипеткой, в резиновые шланги, и завертывают длинными полосками бумаги шириной 3,5-4 см. Бумагу наматывают по спирали, начиная с конца пипетки, погружаемой в жидкость, а на другом конце пипетки бумагу закручивают. Чашки Петр и заворачивают по 2-3 штуки в бумагу (квадратный лист, сторона которого примерно равна трем диаметрам чашки. Чашки помещают на середину листа, загибают его с двух противоположных сторон кверху так, чтобы края налегали друг на друга. Два свободных конца загибают вниз. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, которые готовят с помощью машины, а если ее нетто следующим образом полоску ваты скатывают в тугой валик, равный по толщине диаметру горлышка колбы или пробирки. Валик обертывают в один слой кусочком марли так, чтобы все четыре угла марли сошлись вверху пробки и могли быть затянуты ниткой. Горловину колб, закрытых ватно-марлевыми пробками, перед стерилизацией закрывают ещё бумажными листами и затягивают ниткой. Пробирки, закрытые ватно-марлевыми пробками, заворачивают no 10 штук. Методы стерилизации Методы стерилизации делятся на физические, химические и механические (табл. 2). Физические методы К физическим методам относится стерилизация высокой температурой, радиоактивным излучением, ультразвуком и ультрафиолетовыми лучами. Самым надежными наиболее распространенным методом физической стерилизации является стерилизация высокой температурой. Ф лам б и ров ан и е (flame – пламя) – прокаливание в пламени игл, предметных стекол, бактериологической петли. При прокаливании бактерии и их споры сгорают. Быстрый и надежный метод стерилизации, но применимый к ограниченному количеству предметов. Стерилизация сухим паром проводится в сушильном шкафу печи Пастера), имеющем хорошую асбестовую теплоизоляцию и электро- нагреватель. Показателем достаточной стерилизации является легкое пожелтение бумаги, в которую завернуты стерилизуемые объекты. Поднимать в шкафу температуру выше С нельзя, так как бумага и ватные пробки становятся ломкими и быстро разрушаются. Контроль за температурой в шкафу осуществляется по термометру, помещенному в верхней части шкафа. По окончании стерилизации шкаф можно открыть только тогда, когда температура снизится до комнатной, так как под влиянием струи холодного воздуха горячее стекло может лопнуть. 41 Стерилизация насыщенным паром поддавлен и ем наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, ведущий к гибели самых устойчивых спор. Этим методом стерилизуют большинство питательных сред, перевязочный материал, посуду. Обработку производят в специальном герметически закрытом толстостенном котле – автоклаве. Между стенками котла имеется свободное пространство, по которому образующийся при кипении пар через отверстия поступает во внутреннюю камеру, где расположен стерилизуемый материал. Работа автоклава проходит при давлении выше атмосферного, поэтому он снабжен массивной металлической крышкой, плотно привинчивающейся к котлу специальными болтами. О величине давления судят по показаниям манометра, укрепленного в верхней крышке автоклава. Между показаниями манометра и температурой кипения воды имеется определенная зависимость табл. 3). 6. Одноразовая стерильная посуда Одноразовая посуда (чашки Петри, пробирки, шприцы) изготовляется из полипропилена и полистирола и изначально стерильна (одноразовая посуда может быть обработана методом электронно-лучевой стерилизации. Такая посуда используется однократно и повторной стерилизации не подлежит. Разовая посуда значительно облегчает проведение опытов, но является дорогой и используется не во всех лабораториях. 42 Таблица 2 Методы и факторы стерилизации Методы стерилизации Факторы стерилизации Стерилизуемый объект 1 2 3 Физические методы 1. Фламбирование Высокая температура, приводящая к обугливанию микроорганизмов и спор Бактериологическая петля, пинцет, скальпель, игла, края пробирок, поверхности пробок. Кипячение вводе или вводе с добавлением го раствора карбоната натрия Температура 100 Св течение нескольких часов, с добавлением соды – 15-30 мин Хирургические инструменты, резиновые груши, трубки, шприцы. Обработка сухим жаром в сушильном шкафу (печи Пастера) Температура 160-170 Св течение 1 ч или 150 Св течение 2 ч Стеклянная посуда, пробирки, колбы, чашки Петри, вата, марля 4. Дробная стерилизация а) кохирование Температура 100 Св течение 30-60 мин с последующим проращиванием спор Питательные среды Гисса, содержащие сахара, молоко, желатин (МПЖ) б) тиндализация Температура 52-58 С с последующим проращиванием спор Витамины, лекарственные препараты 5 . Автоклавирование Насыщенный пар при температуре выше 100 Си давлении больше атмосферного Питательные среды МПА, МПБ, перевязочный материал, инфицированный материал Химические методы. Фенол (й раствор карболовой кислоты) Поврежденные белки, цитоплазма обладают максимальной поверхностной активностью Предметные стекла после приготовления мазков, посуда 2. Формалин (й раствор формальдегида) Денатурация белков, грибов, спор Универсальное дезинфицирующее средство, объектов животноводства. Хлорная известь (активный хлор 25% и более) Выделение активного хлора, а затем в процессе реакций – кислорода, окисляющего компоненты клетки Помещения, выгребные ямы, туалеты 4. Хлорная медь (й раствор) Действие активного хлора Материал, загрязненный спорами сибирской язвы 5. Марганцовокислый калий Окислитель, оказывает поверхностное действие Кожные покровы и поверхностные неглубокие раны Механические методы 1. Фильтрование через асбестовые, каолиновые или нитроцеллю- лозные фильтры Величина пор Сыворотка крови, лекарственные препараты Таблица 3 Соотношение показателей манометра и температуры в автоклаве Показатели манометра, атм Температура кипения воды, С 0 100 0,2 105 0,4 110 0,5 112 0,6 114 0,7 116 0,8 117 0,9 119 1,0 121 1,5 127 2,0 134 3,0 144 Нулевым давлениемавтоклава считают нормальное атмосферное давление мм рт. ста атм в автоклаве обозначает давление 1 атм сверх нормального. Для предотвращения взрыва автоклава от превышения давления (выше 2 атм) в его крышке вмонтирован предохранительный клапан, ведущий внутрь котла. Предупреждением o перегреве автоклава служит звук вырывающегося со свистом и шипением пара. Стерилизацию в автоклаве ведут следующим образом через воронку в автоклав наливают воду, уровень которой не должен превышать красную черту на водомерной трубке. Загрузив стерилизационную камеру, закрывают и завинчивают крышку автоклава, открывают кран, соединяющий ее с наружным воздухом, и начинают нагревать воду. Кран держат открытым до тех пор, пока из него не выйдет весь воздух, находящийся в автоклаве, и не пойдет непрерывной струёй пар в ведро с водой. Пока из автоклава вместе с паром выходит воздух, из трубки выделяются большие пузыри воздуха с мягким булькающим звуком при выходе одного пара выделяется лишь небольшое количество мелких пузырьков, состоящих из не успевшего сконденсироваться пара, вырывающихся из трубки с резким треском. Выход струи чистого параизавтоклава соответствует температуре кипения воды – С. После этого кран закрывают, вынимают из ведра с водой отводную трубку и начинают поднимать давление. Для стерилизации питательных сред необходимо атм (С. Для стерилизации почвы, содержащей большое количество споровых микроорга- низмов,или для обеззараживания инфицированногоматериала - 2 атм С) втечение 2 ч, для стерилизациипитательных сред, содержащих сахара всего 0,5 атм (Св течение мин. Необходимое давление под- держиваютв течение всего времени стерилизации, регулируя нагрев автоклава. По истечении времени стерилизации нагревание прекращают и ждут, когда стрелка манометра упадет до нуля, те. до тех пор, пока давление в автоклаве не уравняется с атмосферным. Тогда открывают кран, через который вначале стерилизации выходил пара затем и крышку автоклава. Если преждевременно открыть кран, то перегретые питательные среды сразу же бурно закипают и смачивают, а иногда и выталкивают ватно-марлевые пробкииз колб, что ведет в дальнейшем, при открывании автоклава и вынимании сред, ких расстерилизации. В связи стем, что в автоклаве стерилизуют хирургический материал, очень важно быть уверенным в том, что истинное давление в автоклаве соответствует показаниям манометра. Для этого проверяют работу автоклава в стерилизационную камеру помещают 100 г бензойной кислоты с добавлением фуксина. Если при показаниях в 1 атм бензойная кислота расплавится, образуя с красителем сплав, значит, температура соответствует С, те. автоклав работает нормально. Стерилизацию в автоклаве могут проводить только специально обученные люди, имеющие удостоверениена право работы с автоклавом, а исправность его через определенный срок проверяют работники котлонадзора. Кипячение простейший способ стерилизации. Кипятят иглы, шприцы. Проводится кипячение в специальных стерилизаторах в течение 15- 30 мин с момента закипания воды. Добавление к воде 1-2% соды смягчает воду и предохраняет металлические предметы от ржавчины. Этот метод не всегда дает полную стерилизацию, так как споры некоторых бацилл выдерживают кипячение в течение нескольких суток. Дробная стерилизация Стерилизация текучим паром (кохирование), имеющим температуру С. Можно стерилизовать питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (желатина, молоко, среды с углеводами. Такую стерилизацию проводят в аппарате Коха, поэтому ее называют иногда кохированием. Аппарат Коха – это высокий двустенный металлический цилиндр, в один из цилиндров помещают нагревательный прибора в другой наливают воду. Над водой на сетку устанавливают стерилизуемый материал. Сверху аппарат закрывают конусообразной крышкой с отверстиями, через которые образующийся в аппарате пар свободно выходит, пройдя одна через весь аппарат, отсюда название метода – текучий пар. Продолжительность стерилизации – 30-60 мин с момента закипания воды. При такой стерилизации погибают лишь вегетативные формы бактерий, а споры остаются. После однократного прогрева стерилизуемый материал вынимают из аппарата Коха и помещают на сутки в термостат, где происходит прорастание спори превращение их в вегетативные формы. При повторном прогревании наследующие сутки в аппарате Коха они погибают. к поступают три раза в течение трех суток, попеременно прогревая материал в аппарате и проращивая споры в термостате. Стерилизация осуществляется не сразу и поэтому носит название дробной. 45 Т инд али за ц и я (по имени английского физика Джона Тиндаля, предложившего этот метод) – разновидность дробной стерилизации при более низкой температуре (С помин в течение 5-7 дней подряд. Ею пользуются в тех случаях, когда стерилизуемый предмет не переносит температуру выше С. Осуществляют стерилизацию, нагревая объект в специальной водяной бане, а затем проращивая споры в термостате. Пастеризация Пастеризация (по имени Пастера) не относится в строгом смысле словак стерилизации, так как представляет собой метод однократного прогревания материала (30 мин при 67-70°C или 5-7 мин при СВ результате уничтожаются только вегетативные, в том числе патогенные микроорганизмы. Споровые же формы сохраняются. Метод применяется для обработки молока, пива, вин, икры и др. Пастеризованные продукты длительному хранению не подлежат. Тепловая обработкам о л ока Для молока применяют специальные методы освобождения его от микроорганизмов, которые основаны на том, что неспоровые микрооганиз- мы погибают при более низких температура, чем споровые.  перейти в каталог файлов | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |