Общая_микробиологи_учеб._пособие. Учебно-методическое пособие Новосибирск 2016

48 Тема 2. Типы питательных сред, используемых в микробиологической практике, и основы их приготовления План
1. Требования, предъявляемые к питательным средам.
2. Типы питательных сред
1. Требования, предъявляемые к питательным средам В природе микроорганизмы хорошо растут на самых разнообразных продуктах и субстратах. В лабораторных условиях для работы с микроорганизмами принято использовать специально приготовленные для них питательные среды с заранее известным составом. Это позволяет изолировать определенный вид микроорганизмов от других видов, вырастить, сохранить его, изучить биологию и свойства.
1. Питательные среды не только содержат в себе необходимые питательные вещества, но и одновременно являются средой обитания микроорганизмов. Поэтому при составлении рецептов сред учитывают как требования микробов, таки возможность их осуществлять в данных условиях обмен веществ между клеткой и средой. Необходимыми элементами питания микроорганизмов являются орган о гены углерод, азот, кислород, водород (C, N, O, H), зольные элементы, микроэлементы) в очень малых дозах, стимулирующих рост клеточной массы, ив и там и -н ы . Одни из этих элементов входят в состав белков и нуклеиновых кислот микроорганизмов, другие принимают активное участие в процессах дыхания, включаясь в состав дыхательных ферментов, третьи являются факторами роста и т.д. Чтобы установить значение отдельного питательного элемента для развития микроорганизмов, их выращивают на питательных средах, исключая этот фермент. По результатам выращивания судят о потребности микроорганизмов в данном элементе. В качестве источника азота и углерода в составе питательных сред могут быть использованы либо органические, либо минеральные соединения. Это зависит оттого, каким типом питания обладает данный микроорганизм. Если, например, это амин о авто т ро ф , способный сам синтезировать аминокислоты из минеральных соединений, тов качестве источника азота для него будут приемлемы соли, содержащие азот ((NH
4
)
2
SO
4
, NH
4
NO
3
). Если это амин о гетер от ро ф , использующий готовые аминокислоты для построения белков своего организма, тов питательной среде должны быть белки животного или растительного происхождения (мяса, рыбы, картофеля, бобов и др, или продукты частичного гидролиза белка, из которых микроорганизм почерпнет необходимые ему аминокислоты. В качестве азотистого органического вещества, богатого аминокислотами, в микробиологии широко

49 применяется пептон – продукт неполного расщепления белка, полученный при гидролизе его пепсином в кислой среде. Автотрофы получают углерод из углекислого газа воздуха, создавая при этом из него органические вещества – углеводы. Такие организмы не будут нуждаться в других источниках углерода, кроме углекислоты. Гетеротрофы способны усваивать углерод только из готовых органических соединений – углеводов, спиртов и даже клетчатки ((С
6
Н
10
О
5
)
n
). Поэтому в питательные среды в качестве источника органического углерода могут быть добавлены разнообразные вещества, содержащие углерод, – моносахариды, глюкоза (С
6
Н
12
О
6
) или его аналог галактоза (С
6
Н
12
О
6
), отличающийся от глюкозы лишь пространственным расположением группу го атома углерода, арабиноза из группы пентоз, дисахириды – мальтоза (от англ. malt – солод, или солодовый сахар, состоящий из двух остатков глюкозы, многоатомные спирты – маннит и др. Таким образом, при культивировании микроорганизмов питательная среда должна соответствовать их потребностям в органических и неорганических соединениях азота, углерода, а также в источниках других химических элементов и ростовых веществах.
2. Как и во всех живых организмах, основную часть микробной клетки
(80-90%) общей массы клетки составляет вода, поэтому питательные среды обязательно должны быть влажными.
3. Поскольку каждый микроорганизм проявляет свою жизнедеятельность в определенных границах кислотности среды, среда должна иметь соответствующую рН (реакцию среды, определяемую концентрацией ионов Н. В нейтральной среде, где количество ионов Н+ равно количеству ОН
-
(рН=7), лучше растут бактерии и актиномицеты, в кислой (рН менее 7) – плесени и дрожжи, в щелочной (рН более 7) – холерный вибрион. Определение рН в питательной среде проводят на рН-метре или с помощью универсальной индикаторной бумаги, на которую наносят каплю исследуемой среды. Необходимую рН устанавливают м раствором соды для культивирования бактерий на средах, содержащих белки животного происхождения. При этом нужно учитывать, что в процессе автоклавирования рН среды смещается на 0,1-0,2 в кислую сторону. Как правило, рН питательных сред перед стерилизацией доводят до 7,4, тогда в готовых средах она будет 7,2, что наилучшим образом подходит для культивирования бактерий. При культивировании грибов в питательных средах обычно содержится много солей, что само по себе создает кислую рН. Однако при необходимости доводят рН до
4,3-4,7 однонормальным раствором соляной, молочной или борной кислот.
4. При составлении питательных сред необходимо учитывать концентрацию растворенных вводе соединений стем, чтобы питательная среда была изотонична содержимому клеток микроорганизмов, иначе могут возникнуть явления плазмолиза или пл аз м оп тиса. Размножение микроорганизмов в очень разбавленных или сильно концентрированных средах замедляется или может совсем прекратиться. Для выращивания бактерий добавляют г поваренной соли на 1 л воды для создания нормальной концентрации солей (й для выращивания грибов требуется значительно большее их содержание (3% и более. Это объясняется тем, что осмотическое давление клетки бактерии значительно ниже, чему грибов (3-6 атм, ноне более 20 атм для бактерий и 25-70 атм для грибов.
5. Питательные среды должны быть прозрачными, что обеспечит хорошее наблюдение за ростом микроорганизмов. Для создания прозрачности в процессе приготовления сред их просветляют, добавляя белок куриного яйца, взбитый до пены, с двойным количеством дистиллированной воды.
6. Обязательным требованием, предъявляемым к питательным средам, является их стерильность. Для этого их автоклавируют, кохируют или фильтруют в зависимости от состава. Подготовленные среды проверяют на стерильность. С этой целью их ставят в термостат при Си выдерживают там трое суток для проращивания вегетативных клеток и спор. Проросшие среды бракуются. Продолжительность хранения стерильных средне должна быть большой, так как в результате долгого хранения среды высыхают и изменяют свои свойства.
7. Питательная среда является для микроорганизмов одновременно средой их обитания, поэтому при составлении среды необходимо учитывать отношение микроорганизмов к кислороду. Все перечисленные выше требования, предъявляемые к средам, будут достаточны в том случае, если речь идет о культивировании на них организмов – аэробов. Когда возникает необходимость вырастить анаэробов, нужно использовать специальные среды, в состав которых входят компоненты, изолирующие микробов от наружного воздуха. Так, среда Китт-Тароцци, кроме мясопептонного печеночного бульона (МППБ) содержит вазелиновое масло, которым она заливается сверху. Для удаления остаточного воздуха пробирки со средой перед посевом микроорганизмов выдерживают 15-20 мин в кипящей воде. На этой среде будут хорошо расти анаэробы, а аэробы расти не смогут, несмотря на то, что питательная среда богата всеми необходимыми для них компонентами.

51
2. Типы питательных сред По составу питательные среды подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. Естественные среды представляют собой натуральные продукты овощи, фрукты, сено, молоко, яйца, желчь, сыворотку крови, а также отвары из мяса, рыбы, навоза. Эти среды содержат все необходимые элементы- органогены: зольные элементы, микроэлементы, витамины. Искусственные питательные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых и других веществ. При добавлении к естественной среде, мясному бульону соли (NaCl) и пептона (1%) он превращается в распространенную питательную среду – мясопептонный бульон. Синтетические среды готовят из химически чистых веществ солей, углеводов, аминокислот и других, взятых в определенных соотношениях. Состав таких сред значительно беднее по питательной ценности естественных, и поэтому на них смогут расти далеко не все микроорганизмы. По консистенции питательные среды могут быть жидкие, полужидкие и плотные. Назаре микробиологических исследований использовались в основном жидкие среды (МПБ, молоко, отвары, растворы солей. С введением в практику желатины (белковое вещество, получаемое из вываренных костей, хрящей и сухожилий животных) и агар а (пектинообразное вещество, получаемое из морских водорослей) стали получать полужидкие (студенистые) и плотные среды. Так, мясопептонный бульон (МПБ) при добавлении го агара будет полужидким мясопептонным агаром, при добавлении го агара – плотной средой (МПА, те. плотность среды зависит от количества отвердителя. Среды с агаром стали универсальными, так как очень удобны – температура застывания у них С, а плавления – около С. Желатина плавится при менее низких температурах. Так, при содержании ее около 10% в среде она разжижается при температуре С, поэтому культивировать на ней микроорганизмы выше этой температуры нельзя – результаты культивирования можно трактовать неправильно, приняв естественное разжижение желатины за результат действия на нее фермента жела- тиназы, выделяемого микроорганизмами. При выращивании микроорганизмов на разных по консистенции средах можно узнать их культуральные свойства, те. свойства, присущие культуре данного вида микроорганизма в целом. Так, на жидких питательных средах (например, на МПБ) по поверхностному, придонному росту микроорганизмов или по равномерному помутнению среды можно судить об отношении микроорганизмов к кислороду. На полужидких агаризированных средах хорошо наблюдается процесс выделения газообразных продуктов распада питательных веществ, вызванный микроорганизмами. На плотных средах

52 хорошо изучать характер роста колоний, производить подсчет количества высеянных микроорганизмов. По назначению питательные среды делятся на обычные, элективные и дифференциально-диагностические. Обычные среды МПА, МПБ, рыбный агар – применяются для выращивания большинства гетеротрофных микроорганизмов – сапрофитов. Дифференциально- диагностические среды применяются для изучения биохимической активности микроорганизмов, те. их способности разлагать те или иные вещества и степени этого разложения. Они помогают отличить (дифференцировать) один вид микроорганизма от другого. Широко применяются полужидкие среды Гисса, представляющие собой 0,5% МПА с добавлением различных сахаров – глюкозы, сахарозы, маннита и др. В эти среды в процессе их приготовления добавлен специальный индикатор (вещество, меняющее окраску в зависимости от рН среды.
Из многочисленных индикаторов в среды Гисса принято добавлять индикатор ВР (водный голубой с розоловой кислотой. Элективные или избирательные) среды введены в практику русским микробиологом С.Н. Виноградским и сыграли большую роль в изучении почвенных микроорганизмов. Сам С.Н. Виноградский так определял понятие элективные среды «…элективна, если она благоприятна для обнаружения одной определенной функции, возможно тесно ограниченной. Чем более узки или даже исключительны будут условия, тем более известный вид, обладающий данной способностью, окажется в благоприятных условиях по сравнению с другими, этой способностью не обладающими. Поэтому среда элективна не только по составу, но и по своим условиям, те. элективна в более широком смысле этого слова. Элективной средой для культивирования сенной бациллы (Bacillus subtilis), имеющей устойчивые споры, будет следующая. Сено, мелко нарезанное, помещают в коническую колбу, заливают водой, добавляют щепотку мела и кипятят 15 мин. После этого колбу закрывают обожженной ватно-марлевой пробкой и помещают в термостат Сна суток. Поскольку при кипячении вегетативные формы различных бактерий погибают, останутся только споры сенной палочки, всегда присутствующие в сене. На питательном отваре, в который добавлен мел для легкого подщелачивания среды (рН=7,2), споры прорастут, и на поверхности сенного отвара образуется сероватая пленка. Микроскопическое исследование и окраска по Граму дадут возможность убедиться в том, что выросла одна культура. Элективной средой для культивирования картофельной бациллы
(Bacillus mesentericus) будет следующая промытые неочищенные клубни картофеля нарезают ломтиками, натирают их поверхность мелом, кладут в чашки Петри и выдерживают 10 мин в сушильном шкафу при С, чтобы убить постороннюю флору, затем чашки помещают в термостат при Сна суток. К концу этого срока на поверхности картофеля образуется плотная морщинистая пленка, состоящая из особей картофельной палочки.

53 Микроскопическое исследование мазка, окрашенного по Граму, подтверждает, что растет одна культура. Элективной каждая из этих сред является не только по составу, но и по преимущественным условиям, созданным для данных видов микроорганизмов в результате уничтожения неспоровых бактерий. Специальные среды применяются для выделения и культивирования определенных групп микроорганизмов. Бактерии тифозно- паратифозной группы, выделяемые от больного животного с фекалиями, можно сеять на среды, содержащие 10-20% желчи. Поскольку бактерии этой группы внедряются в верхние отделы двенадцатиперстной кишки, желчь является для них естественной средой обитания, и на ней они будут развиваться хорошо. Остальные бактерии, в том числе и кишечная палочка, находятся обычно в толстых отделах кишечника, желчь для них не является естественной средой, и развитие другой микрофлоры будет замедленно. Среда Чапека, содержащая набор различных минеральных солей в качестве источника азота, серы, фосфора, калия, железа и глюкозу в качестве источника органического углерода, будет специальной средой для культивирования грибов, так как в ней обеспечиваются условия для преимущественного роста именно этой группы микроорганизмов (рН меньше 7, большое осмотическое давление, отсутствие органического азота. Выбор той или иной питательной среды для культивирования микроорганизма обусловливается задачами исследования и типом питания микроорганизмов. Особенности питания микрорганизмов (автотрофные или гетеротрофные) зависят в конечном счете от набора ферментов, которым обладает каждый вид микроорганизма. В свою очередь, набор ферментов обусловлен наследственной информацией, записанной в генетическом коде микроорганизмов. Вопросы для самостоятельной работы
1. Перечислить 7 основных требований, предъявляемых к питательным средам. Что такое рН и как его определить
3. Примеры искусственных, естественных и синтетических питательных сред.
4. Приготовление плотных питательных сред.
5. Элективная среда для картофельной палочки.
6. Элективная среда для сенной палочки.
7. Дифференциально-диагностические среды. Библиографический список Основной
1.
Асонов Н.Р. Микробиология. – е изд, перераб. и доп. – М Колосс.
2.
Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии М Агропромиздат, 1988.

54 3.
Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – М Высш. шк, 1981. С. 5-10. Дополнительный
4.
Мудрецова – Висс КА Микробиология, санитария и гигиена учеб. для вузов КА. Мудрецова – Висс, А.А. Кудряшова и др е изд. – М Изд. дом Деловая лит, 2001.
5.
Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин – М Колос,
1993.
6.
Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, В.К. Шильникова – М Агропро- миздат, 1990.
7.
Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова,
Г.И. Переверзева. – М Колос, 1993.

1   2   3   4   5   6   7   8   9

перейти в каталог файлов