Общая_микробиологи_учеб._пособие. Учебно-методическое пособие Новосибирск 2016

64 Тема 5. Микрофлора почвы Почва является благоприятной средой для развития и накопления многих видов микроорганизмов, патогенных для животных. Вместе стем в почве осуществляются с помощью различных групп микроорганизмов такие важные процессы, как аммонификация, нитрификация, азотфиксация. Наличие большого количества микробов в почве является условным показателем плодородия. Определение общего количества микробов в почве В почве находится огромное количество бактерий (от 200 млн до 5 млрд в I г почвы, и для облегчения их учёта почву перед посевом разводят в стерильной дистиллированной воде. В штатив ставят ряд пробирок, содержащих по 9 мл воды. В первую пробирку высыпают 1 г исследуемой почвы (разведение 1:10), тщательно перемешивают в течение 3-5 мини переносят пипеткой 1 мл во вторую пробирку (разведение 1:100). Вновь тщательно перемешивают и переносят мл в третью пробирку, где получают разведение 1:1000. Из третьей пробирки после тщательного перемешивания переносят 1 мл в четвёртую пробирку (получают разведение 1:10000) и, наконец, из четвёртой – в пятую разведение 1:100000) (рис. 15). Рис. 15. Разведение почвы для посева Для посева почвы используют разведение 1:10000 или 1:1000. Выливают пипеткой 1 мл разведения на дно пустой стерильной чашки Петри и заливают мл расплавленного и охлаждённого до С МПА. Перемешивают осторожным покачиванием чашки почвенную болтушку с питательной средой. После застывания агара чашку ставят в термостат с температурой С. Для подсчёта наследующем занятии берут чашки, на которых вырастет от 50 до 150 колоний. Чашки с количеством колоний менее 50 считают недостоверными
Подсчёт колоний в чашках Петри можно производить с помощью счёт- ной камеры Вольфгюгеля или автоматического счётчика колоний. При под- счёте общего количества микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы, учитывают разведение почвы. Так, если в чашке с разведением 1:10 000 выросло
70 колоний, в 1 г почвы содержится х 000 микроорганизмов. Наиболее богаты микроорганизмами чернозёмы и каштановые почвы. В почвах, богатых органическими веществами, количество бактерий может достигать несколько миллиардов в 1 г. Количество актиномицетов не превышает 10 млн, а грибы встречаются в количестве сотен тысяч. Определение санитарного состояния почвы Ценными показателями санитарного состояния почвы является обнаружение Escherichia coli и коли- морфных бактерий, Streptococcus faecalis, Clostridium perfringens, а также определение общего количества микроорганизмов в 1 г почвы — общего микробного числа (ОМЧ). О санитарном состоянии почвы судят по индексу
БГКП или по титру Cl. perfringens. Эти микроорганизмы встречаются в кишечнике животных, человека и свидетельствуют о загрязнении почвы фекалиями, припопадании в раны, может явиться возбудителем газовой гангрены – тяжёлого заболевания с омертвением тканей. Определение титра кишечной палочки производят, посеяв на среду Эндо 1 каплю раз- ведённой почвенной суспензии (выбирают разные разведения. Показатели- санитарного состояния почвы приведены в табл. 4. Подробно методика изложена в Рабочей тетради по микробиологии. Таблица 4 Оценка степени эпидемической опасности почвы
Категория загрязнения
почв
Индекс
БГКП Индекс энте- рококков Патогенные бактерии, в т.ч. сальмонеллы Яйца геогель- минтов, экз/кг Личинки - Л куколки - К мух, экз, в почве с площадью см Чистая
1 - 10 1 - 10 0
0 0 Умеренно опасная
10 - 100 10 - 100 0 до 10 Л до 10 К - отс. Опасная
100 - 1000 100 - 1000 0 до 100 Л до 100 К до 10 Чрезвычайно опасная
1000 и выше 1000 и выше
0
> 100 Л > 100 К > 10 Для определения титра Clostridium perfringens пользуются разведением почвы от 1:10 до 1:1000. Из каждого разведения 1 мл вносят в пробирки с 5 мл молочной среды Тукаева (я пептонная вода с 5% обезжиренного молока. Для освобождения от посторонней неспороносной микрофлоры посевы прогревают при Сна водяной бане в течение 1 мина затем выращивают в термостате. Наследующем занятии анализируют результаты посева. Размножение
Clostridium perfringens сопровождается свёртыванием молока в виде губчатого сгустка, всплывающего на поверхности среды вследствие газообразования с полным отделением сыворотки. При микроскопическом исследовании обнаруживаются крупные, толстые, грамположительные палочки со спорами овальной формы, расположенными центрально или субтермально. Предельное разведение почвы, дающее на молочной среде рост Clostridium
perfringens, означает титр этого микроба в почве. Определение актиномицетов (лучистых грибков. Актиномицеты – прокариоты, поэтому они относятся к бактериям, а не к грибам, хотя это и следует из названия. Поэтому в современной систематике их называют Ac-
tinobacteria. Для этой группы микроорганизмов почва – нормальная среда обитания, но их можно обнаружить в воздухе, воде и на растениях. Актино- мицеты продуцируют сильные ферменты и могут быть причиной болезни у крупного рогатого скота – актиномикоза. Заражение происходит через полость рта при повреждении слизистой грубыми кормами, на которых имеются споры актиномицетов. Поражаются лимфатические узлы в области язычка, полости рта и глотки. Заражение человека наблюдается при дурной привычке
– жевании колосьев, на которых с пылью из почвы попадают споры актино- мицетов. Проникая в подслизистую оболочку рта, актиномицеты начинают развиваться и проникают в лимфатические узлы, вызывая их актиномикоз. Познакомиться с актиномицетами можно, посеяв разведённую почвенную суспензию на крахмало-аммиачный агар (среда КАА). Определение грибов В почве содержится большое количество грибов до 1 млн./г), которые, воздействуя своими ферментами на растительные остатки, способствуют их переработке, при этом грибы разрушают не только целлюлозу, но и лигнин. Грибы играют важную роль в образовании гумуса и способствуют повышению плодородия почвы. Определить количество грибов можно, посеяв каплю разведённой почвенной суспензии на среду Чапека, подкисленную до pH 5,0, что обеспечивает преимущественный рост грибов перед бактериями (см. Рабочую тетрадь. Определение азотфиксирующих микроорганизмов Одним из важнейших процессов, происходящих в почве, является фиксация атмосферного азота (и превращение его из инертного газа в форму, доступную для питания растений. К настоящему времени описаны многочисленные микроорганизмы, обладающие такой способностью, относящиеся как к аэробам, таки к анаэробам. Первым из азотфиксаторов был описан С.Н. Виноградским спо- рообразующий анаэроб Clostridium pasterianum. Определить наличие этих микроорганизмов в почве можно, посеяв почву в пробирки с жидкой питательной средой Виноградского без азота, налитую высоким столбиком для создания анаэробных условий. Микроскопия осадка через 2 недели роста при наличии Cl. pasterianum в почве даст возможность увидеть большое количество клостридиальных клеток. Определение азотобактера, обладающего способностью к фиксации атмосферного азота в аэробных условиях, проводят следующим образом. Небольшое количество почвы увлажняют до пастообразного состояния, хорошо растирают и перемешивают в фарфоровом тигле. Бактериологической петлёй берут комочки почвы и раскладывают их правильными рядами на агар Эшби
– до 50 комочков на чашку. Агар Эшби представляет собой питательную элективную среду для азотфиксирующих микроорганизмов, так как в состав среды не входит источник азота (глюкоза – 20 г, K
2
HPO
4
– 0,2, MgSO
4
– 0,2,

69
5. КРАТКИЙ СЛОВАРЬ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ Приборы и оборудование микробиологической лаборатории Автоклав – аппарат для стерилизации объектов (питательных сред) высокотемпературным насыщенным водяным паром (паром под давлением. Автоматическая средоварка – прибор для приготовления сред. Достаточно сложный процесс подготовки агара и бульона может проводиться автоматически, легко и безопасно с помощью аппаратов (средоварок) серии
AGARSTER. Автоматические средоварки реализуют полный автоматический цикл при подготовке питательной среды непосредственно подготовка (смешивание и нагревание, стерилизация, охлаждение и хранение среды при постоянной температуре для дозировки.
Агар (такое написание слова было принято после 1978 г.)(от малайского агар-агар — водоросли, или от малайского агар — желе) — продукт смесь полисахаридов агарозы и агаропектина), получаемый путем экстрагирования из красных (филофора) и бурых водорослей (Gracilaria, Gelidium,
Ceramium и др. Агар-агар – полисахарид, преимущественно состоящий из сложных эфиров сульфатов кальция, натрия, галактозы и 3,6 сополимеров ангидрогалактозы. Используется в микробиологии для приготовления плотных питательных сред. Агар нерастворим в холодной воде. Он полностью растворяется только при температурах от 95 до 100 0 С . Горячий раствор является прозрачными ограничено вязким. При охлаждении до температур 35-
40 0 Сон становится чистыми крепким гелем, который является термообра- тимым. При нагревании до 85-95 0 Сон опять становится жидким раствором, снова превращающимся в гель при 35-40 0 С Используется как отвердитель при приготовлении питательных сред. Агар не расщепляется большинством микроорганизмов и не изменяет питательную ценность сред. Последние нередко называют соответствующим агаром: молочный А, картофельный А, яичный Аи др. В микробиологических целях впервые применён ФА. Хес- се, сотрудником Р.Коха, в 1883 г.
Агароза – главная фракция агара, представляющая собой линейный полисахарид, построенный из строго чередующихся остатков галактопирано- зы. Используется как гелевая среда в хроматографии и электрофорезе. Агар кровяной – готовится на основеобычного агара. Для этого к 5 частям слабощелочного питательного агара, который расплавляется до С, добавляют 2 части дефибринированной стерильно взятой крови (человека или кролика. После розлива в чашки Петри и пробирки кровяной агар ставят для контроля на стерильность в термостат на одни сутки. Используют для определения способности микроорганизмов вызывать гемолиз.

70 Ампула – небольшой стеклянный суживающийся к одному концу сосуд. После заполнения сосуда суживающуюся часть запаивают для создания надежной герметичности.
Анаэростат – прибор для создания и поддержания стабильно анаэробных условий. Применяют для культивирования анаэробов. Антисептические материалы – материалы медицинского и иного назначения, пропитанные стойкими антисептиками. К ним относятся бактерицидный пластырь, салфетки, тампоны, бактерицидный пластырь, шовный материал, волокна, ленты. Антисептик постоянно диффундирует с материала в окружающую среду и оказывает длительное антимикробное действие. Аппарат Коха – двухстенный цилиндрический сосуд с нагревателем, крышкой, отверстием для выхода пара, термометром, служащий для стерилизации питательных среди растворов текучим паром. Температура стерилизации С, экспозиция 30 мин 3 дня подряд с последующим проращиванием в термостате. Бактериологическая игла – инструмент, состоящий из пластмассового держателя и металлического стержня, закругленного в виде маленькой петли, или в виде прямого свободного конца. Ее применяют для посева культуры или материала в столбик плотных питательных сред. Бактериологическая петля – инструмент микробиологических лабораторий. Используют для забора материала, взятия, переноса, смешивания и других процедур с небольшой дозой культур бактерий или других микроорганизмов. Состоит из пластмассового или металлического держателя и петли. Петлю бактериологическую стерилизуют до начала и после работы прокаливанием на пламени горелки в течение 15 с. Бокс (от англ. box – коробка) – специальные изолированное помещение или часть помещения, предназначенное для выполнения работ, требующих особой стерильности и безопасного пребывания людей. Бокс настольный – коробка небольших размеров, приготовленная из стекла и металла, имитирующая большой бокс.
Водяная баня – прибор, в котором происходит равномерное постепенное нагревание питательной среды, исключающее ее подгорание при приготовлении, так как расплавление среды идет медленно. Прибор может использоваться для тиндализации. Гомогенизатор – аппарат для получения однородных, мелко измельченных смесей, а также эмульсий высокой дисперсности. Диск – кусок специальной бумаги, круглой формы, диаметром 5-7 мм пропитанный антибиотиком или другими препаратами, и предназначенный для проверки чувствительности бактерий и грибов к антибиотикам на плотных средах. Диски должны храниться в закрытых контейнерах при 8°- С. Дистиллированная вода – наиболее чистая вода (насколько это вообще возможно. Дистилляция по латыни примерно означает обезличивание, таким образом, обезличивание воды подразумевает удаление из нее растворенных соединений (солей) и приведение к некоторому идеалу, в котором если и есть остатки веществ, то они настолько малы, что их можно не учитывать. Дистиллятор – прибор для перегонки воды с целью получения жидкости, свободной от примесей. Принцип дистилляции воду испаряют в дистилляционном аппарате, а затем конденсируют в охлаждающем устройстве, где она снова переходит в жидкую форму. Когда вода переходит из одного агрегатного состояния в другое, примеси, содержащиеся в ней, остаются в качестве осадка. Конденсируемый водяной парне содержит солей, органических веществ и микроорганизмов. В дистилляте могут присутствовать только летучие вещества (такие, как, например, спирты, которые также испаряются и конденсируются вместе с водой.
Колбонагреватель одноместный прибор для нагревания колбы с каким- либо раствором до нужной температуры.
Кохирование – метод дробной стерилизации, предложенный Кохом. Основан на уничтожении спор микроорганизмов после проращивания спори превращения их в вегетативные формы. Кохирование проводится х кратно при температуре С. Красители кислые – вступают в реакцию с компонентами клетки основной природы (NH
2
-
). Примеры кислых красителей красные и розовые кислый фуксин, эритрозин; черные – нигрозин желтые — конго, пикриновая кислота, флуоресцин и др. Красители основные – вступают в реакцию с компонентами клетки кислотной природы (COOH
-)
. Примеры красителей этого типа красные – нейтральный красный, сафранин, фуксин основной, гематоксилин синие – виктория, метиленовый синий фиолетовые – генциан-фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый зеленые –янус зеленый, метиленовый зеленый, малахитовый зеленый коричневые –везувин
перейти в каталог файлов