Практикум учеб пособие Ковальчук Л. В. и др. 2010. 176 с ил
 Скачать 4.21 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
 С этим файлом связано 51 файл(ов). Среди них: Degtyarev_Gastroenterologia.pdf, Levontin_Chelovecheskaya_individualnost.pdf, Uchebnik_N_N_Alipov_Osnovy_meditsinskoy_fiziolo.pdf, 5.png?extra=7lw9h4cikwtBS2A8fENdISxnlBrFPL4oa1md5g_xkqCFZwE__jbl, 19_Metody_profilaktiki_nasl_bolezney.docx, legionellez2009.pdf, Patologia_pecheni.doc, Normalnaya_fiziologia_Agadzhanyan.rar, Sablin_O_A__Grinevich_V_B_-_Funktsionalnaya_dia.pdf и ещё 41 файл(а). Показать все связанные файлы
|
| |
Рис. 4.6. Принцип конкурентного (а) и ингибиторного (б) ИФА
Рис. 4.7. Планшет с результатами ИФА
рентных и ингибиторных. Аналогичная технология применима и с использованием одного антитела (и на твердой фазе, и в составе конъюгата с ферментом) в случаях наличия на заданном антигене повторяющихся эпитопов. В современных модификациях ту же технологию называют ловушечным ИФА (capture IA) - антитела на твердой фазе «ловят» свой антиген из смеси веществ в биопробе.
Рис. 4.8. Принцип «сэндвич»-ИФА
Иммунометрический анализ
При иммунометрическом анализе (рис. 4.9) в пробирку с испытуемой пробой, предположительно содержащей определяемый антиген, вносят заведомый избыток меченых антител. Затем к этой смеси добавляют также заведомый избыток иммобилизованного на мелкодисперсной твердой фазе антигена. После инкубации центрифугированием отделяют растворимую фракцию (супернатант) и в ней измеряют ферментативную активность (если метка - фермент).
Ферментативная активность супернатанта прямо пропорциональна содержанию антигена в испытуемой биопробе. Благодаря использованию избытка реагентов этот метод более чувствителен, чем конкурентный ИФА, и его аналитические возможности приближаются к предельным.
Рис. 4.9. Принцип иммунометрических анализов: 1 - пробирка с биопробой (сывороткой крови или др.); 2 - в пробирку с биопробой вносят заведомый избыток чистого антигена, сорбированного на мелкодисперсном твердофазном носителе; 3 - затем в ту же пробирку вносят заведомый избыток меченых антител; 4 - материал инкубируют (чтобы реагенты успели связаться), центрифугируют и в супернатанте измеряют количество метки. Величина сигнала в супернатанте прямо пропорциональна содержанию искомого вещества (антигена) в испытуемой пробе. OD - optical density - величина оптической плотности, измеренная спектрофотометром; АГ - концентрация искомого антигена в биопробах
| |
Непрямые иммуноанализы
Непрямые методики (рис. 4.10) применяют чаще, чем прямые.
Непрямым иммуноанализом называют анализ, в котором метку присоединяют не к целевому антигену и не к антителу против целевого антигена, а к так называемым вторым антителам - антивидовым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.
Рис. 4.10. Принцип непрямых иммуноанализов
Таким образом, один и тот же препарат конъюгата антиглобулиновых антител с ферментом используют в качестве проявляющего стандартного реагента в разных тест-системах для определения различных конкретных антигенов или антител.
Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека. Все описанные схемы постановки прямого варианта ИФА (конкурентный, ингибиторный, «сэндвич», иммунометрический) применяют и в непрямом варианте.
Непрямые варианты ИФА не требуют очистки искомых антигенов или антител. Чистым должен быть только препарат антивидовых антииммуноглобулиновых антител.
В качестве ферментов-меток в ИФА используются следующие ферменты и субстраты для них.
1. Пероксидаза из корней хрена, субстраты:
• орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);
• 3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый);
• 3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый);
• 5-аминосалициловая кислота (продукт коричневый, растворимый, поглощает при 405 нм);
• 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота (продукт зеленый, растворимый, поглощает при 405 нм);
| |
• 4-хлоро-1-нафтол(продуктголубой,нерастворим);3,3'-диметокси- бензидин (продукт желто-оранжевый, растворимый, поглощает при 405 нм);
• 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (продукт голубой, растворимый, поглощает при 450 нм);
• ABTS - 2,2'-азино-ди(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновая кислота.
2. β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин).
3. Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм).
4. Уреаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).
Нерастворимые продукты ферментативных реакций используют в методах иммуногистохимии и иммуноблота, растворимые - в иммуноферментных анализах, в которых результат регистрируют количественно спектрофотометрически.
Встречаются оригинальные разработки с использованием других (кроме вышеперечисленных) ферментов-меток.
Если по тем или иным биохимическим причинам заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты. Например, нередко используют так называемое «авидинбиотиновое» взаимодействие. Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd 10-15 M) связывает биотин. Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела (существуют коммерческие
| |
препараты). Соответственно все эти дополнительные компоненты используют при необходимости в конструкциях тест-систем, предназначенных для детекции того или иного заданного вещества. Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.
В конкретных вариантах тест-систем используют разные буферные растворы, соответствующие свойствам конкретных антигенов, ферментов и их субстратов. Для примера мы опишем последовательность действий и используемые реагенты при выполнении непрямого твердофазного иммуноанализа, его простой и часто встречающийся вариант, подходящий, в частности, для определения специфических противовирусных антител как маркера наличия в организме той или иной вирусной инфекции (специфическую лабораторную диагностику вирусных инфекций применяют для выявления инфицированности ВИЧ, вирусами гепатитов, герпеса, цитомегаловирусами и др.).
Лабораторная работа 4-2
Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ
1. На твердую фазу стандартных 96-луночных планшетов сорбируют заданные антигены. В большинстве тест-систем используют в качестве антигенов либо рекомбинантные белки, либо синтетические пептиды, реже - компоненты лизата натуральных вирусов. Антигены растворяют до конечной концентрации 1-10 мкг/мл или опытным путем подбирают более подходящие концентрации, чаще всего в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере при рН 9,6.
Для приготовления 1 л буферного раствора берут 0,015 М (1,59 г) Na2CO3 и 0,035 M, 94 г NaHCO3 и растворяют в воде.
Раствор АГ вносят в лунки планшетов в объеме 50-100 мкл.
Существуют другие варианты посадочных буферов, например фосфатно-солевой буфер, рН 7,2 (PBS).
Для приготовления 1 л раствора PBS берут 0,0025 М дигидрофосфата натрия (0,345 г NaH2PO4 × H2O, MW 137,99); 0,0075 М гидрофосфата натрия (2,68 г Na2HPO4 × 12 H2O, MW 358,14) и 0,145 М хлористого натрия (8,474 г NaCl, MW 58,44).
| |
Время, отводимое на сорбцию, подбирают опытным путем. Как правило, достаточно 12-16 ч при комнатной температуре или при +4 °С.
2. Лунки планшета тщательно промывают фосфатно-солевым буфером или водой с детергентом (0,1% Tween-20) 5-10 раз. В современных лабораториях процедуры отмывки осуществляют в аппаратах типа «вошер» (англ. to wash - мыть).
3. В некоторых случаях на следующем этапе в лунки вносят 1% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) или иного консервативного белка, например казеина, для так называемой «забивки» не покрытых антигеном площадей на дне лунок. Инкубируют 30-60 мин, после чего отмывают.
4. В лунки вносят исследуемые образцы биопроб в тех или иных разведениях. Для каждого разведения используют 2-3 лунки («параллели»). В качестве разводящей жидкости применяют PBS. В некоторых случаях в него добавляют 1% БСА. Инкубируют 1 ч и дольше. Время либо подбирают опытным путем, либо следуют инструкции к коммерческой тест-системе.
5. Отмывают (как описано выше).
6. Вносят конъюгат антииммуноглобулиновых антител с ферментом в заранее подобранном рабочем разведении или по инструкции к тест-системе. Инкубируют 1 ч.
7. Отмывают (как описано выше).
8. Вносят в лунки раствор субстрата того фермента, который входит в состав антииммуноглобулинового конъюгата. Если фермент - пероксидаза хрена, то субстратами могут быть ортофенилендиамин и перекись водорода. Эти субстраты растворяют в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5: цитрат χ H2O 0,0347 M (7,3 г/л, MW 210,14); гидрофосфат натрия 0,0667 M (Na2HPO4 × 12 H2O 23,87 г/л, MW 358,14).
На один планшет требуется 10 мл раствора. C небольшим запасом к 12 мл субстратного буфера добавляют 8 мг ортофенилендиамина и 5 мкл 30% перекиси водорода, быстро растворяют и раскапывают по лункам.
| |
9. Через 15-30 мин в лунках, где произошла реакция «антиген- антитело», появится желто-коричневая окраска. Другие лунки останутся бесцветными. Для остановки ферментативной реакции в лунки вносят по 50 мкл 1 М раствора серной кислоты (55,5 мл 96 серной кислоты на 900 мл воды; строго добавлять кислоту в воду, а не наоборот!!!).
10. Интенсивность ферментативной реакции измеряют в единицах величины оптической плотности на спектрофотометрах, приспособленных для планшетов («мультисканах»). Для ортофенилендиамина
длина волны проходящего света должна быть 492 нм (для тетраметилбензидина - 450нм). В связи с этим в мультискане устанавливают соответствующий светофильтр.
11. Современные спектрофотометры оснащены программным обеспечением, в котором предусмотрен автоматический расчет средних значений между параллелями и сравнение опытных показателей с показателями в контрольных лунках. Если такого обеспечения нет, то результаты анализируют «вручную».
Оптическую плотность (OD - optical density) в контрольных лунках принимают за некий «фон». Эти показатели умножают на 2; такую величину условно принимают за «линию раздела» - границу (cut off) между положительными и отрицательными значениями OD: значения ниже «cut off» считают отрицательными, значения выше «cut off» - положительными, значения, близкие к «cut off», - неопределенными, или «серой зоной».
Метод иммуноблота
Метод иммуноблоттинга (первоначальное название Western blot, WB1) был разработан главным образом в целях обнаружения в сыворотках пациентов антител, реагирующих с отдельными белками возбудителей инфекционных заболеваний, чаще всего вирусов.
Метод представляет собой следующее.
| |
1. В культурах клеток in vitro (в настоящее время, как правило, в промышленных масштабах) выращивают препаративные количества реплицирующихся вирусов.
2. Клетки разрушают (ультразвуком или иначе), вирусную массу выделяют из культуральной смеси методами ультрацентрифугирования.
3. Вирусные частицы диссоциируют на отдельные белки детергентами и подвергают электрофорезу в геле. В результате каждый вирусный белок в соответствии со своей молекулярной массой и электрическим зарядом занимает определенную позицию в геле. Без применения красок и специальных проявляющих реагентов фракционированные электрофорезом белки в геле не видимы глазу.
1 Впервые блестящая методическая идея «блоттинга» (переноса на «промокашку»; blot по-английски - пятно на промокашке) пришла в голову и была реализована применительно к электрофоретическому анализу ДНК биохимиком E.M. Southern в 1975 г. Из уважения к автору коллеги-биохимики воспользовались лингвистической особенностью фамилии Southern (южный) и тот же метод, примененный к РНК, назвали Northern blot (северный), а к белкам - Western blot (западный).
4. В целях существенной экономии дорогостоящих реагентов в дальнейшем фракционированные белки из геля «промокают», перенося таким образом на плоский пористый материал - нитроцеллюлозу. В производственных масштабах перенос продуктов электрофоретического разделения в геле на нитроцеллюлозу осуществляют также электрофорезом.
5. Лист нитроцеллюлозы с перенесенными на нее электрофоретически разделенными белками вируса нарезают на тонкие полоскистрипы (strip), соответствующие по формату специальным выпускаемым промышленностью пластмассовым «корытцам», в которых стрипы обрабатывают испытуемыми сыворотками и проявляющими реагентами.
| |
6. Стрип заливают испытуемой неразведенной и разведенной 1:10 (или подбирают иные разведения) сывороткой, инкубируют 1 ч или более, тщательно промывают фосфатным солевым буфером с детергентом (0,1% Tween-20), заливают раствором конъюгата антииммуноглобулиновых антител с ферментом (например, пероксидазой хрена), инкубируют 1 ч, тщательно промывают, вносят раствор субстрата (например, ортофенилендиамина с перекисью водорода), после чего наблюдают, не проявятся ли окрашенные полосы в зонах расположения фракционированных вирусных белков.
В случае, если у человека в крови нет противовирусных антител, стрип остается неокрашенным (имеет место лишь неспецифический легкий фон по всей площади стрипа). Это отрицательный результат. Если окрашенными оказываются все полосы вирусных белков, результат квалифицируют как положительный. Если окрашиваются не все, а 1-2 полосы, результат рассматривают как неопределенный.
Ложноотрицательные результаты в иммуноблоте крайне маловероятны. Поэтому по международным соглашениям сертифицированные для клинической диагностики промышленно выпускаемые иммуноблоттинговые тест-системы приняты в качестве подтверждающих по отношению к планшетным и прочим скрининговым иммуноанализам. На рис. 4.11. представлена схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга.
Рис. 4.11. Схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга
4.3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ, СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМ ИММУНОАНАЛИЗОВ
Чувствительность иммуноанализов
Термин «чувствительность» применительно к иммуноанализам имеет два разных смысла.
1. Чувствительность в физико-химическом понимании - это определяемая данным анализом минимальная концентрация искомого вещества в пробе. Как правило, для большинства ИФА-тест-систем такая чувствительность составляет нанограммы в миллилитре.
| |
2. Второе понимание термина «чувствительность» - популяционное и относится к диагностическим тест-системам, предназначенным для выявления тех или иных маркеров заболеваний, чаще всего инфекционных.
При разработке любой тест-системы пользуются биологическим материалом, скажем, пробами крови людей, заведомо больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно позитивными), и людей, заведомо не больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно отрицательными).
Параметры рассчитывают по приведенным ниже формулам, где N - число тех или иных результатов конкретных анализов на биологическом материале от пациентов с достоверно известными диагнозами.
Чувствительность иммуноанализа в данном случае - это параметр, всегда привязанный к конкретной тест-системе, а не только к принципу метода. Чувствительность зависит от аффинности и авидности взаимодействия используемых (или искомых) антител с искомым (или используемым) антигеном, от других реагентов, включенных в систему, от времени и температуры инкубаций.
Поскольку связывание антител с антигенами не подчиняется линейным зависимостям, то в целях попадания в «зоны эквивалентности» практически во всех вариантах иммуноанализов принято так называемое титрование сывороток или растворов антигенов, т.е. сыворотки (или растворы антигенов) разводят известным образом (двукратные, пятикратные, десятикратные или иные разведения) и каждое из разведений пускают в иммуноанализ. Для того чтобы установить нижнюю границу достоверных признаков связывания антител с антигеном (cut-off - граница отличия отрицательных результатов от положительных), в каждой постановке иммуноанализов обязательно применение заведомо отрицательных и заведомо положительных контрольных сывороток. Если целью анализа является определение не титров сывороток, а численных концентраций искомых антител или антигенов, то прибегают к калибровке. Для этого тест-система должна располагать калибровочными растворами (от 3 до 10 точек), содержащими известные нарастающие концентрации искомого вещества, а система регистрации результатов тоже должна быть «оцифрована», например в единицах оптической плотности, измеряемых спектрофотометрически, или в единицах флюоресцентного излучения, измеряемого флюориметрами, или в единицах числа импульсов в минуту, измеряемых счетчиками радиоактивности (в случае радиоиммуноанализов). В диапазонах прямолинейности калибровочной кривой возможно определение искомых концентраций в испытуемых биопробах.
| |
Учитывая сказанное, мы приведем лишь порядок концентраций, выявляемых с помощью различных технологий иммуноанализов. При этом конкретные тест-системы в пределах одной технологии могут по чувствительности отличаться друг от друга также на порядки.
Методы преципитации, агглютинации и иммунодиффузии работоспособны при концентрациях искомых веществ порядка миллиграммов на миллилитр. Как правило, калибровочные растворы имеют диапазон концентраций от 1 до 0,1 мг/мл.
Твердофазные радиоиммуноанализы и иммуноферментные анализы работают в большинстве тест-систем в нанограммовых диапазонах концентраций (нанограммы на миллилитр). Однако ловушечные конструкции тест-систем, а также иммунометрические тест-системы могут иметь существенно более высокую чувствительность, например 10-12-15 г/мл.
Специфичность иммуноанализов
Специфичность диагностической тест-системы - параметр, характеризующий ее распознавательные возможности в отношении именно данного заболевания, которое она «не путает» с другими.
Диагностическая эффективность тест-систем
Диагностическая эффективность - это параметр, характеризующий возможности данной тест-системы одновременно правильно определять позитивные пробы как позитивные, а негативные пробы - как негативные.
Положительная и отрицательная предсказательная значимость тестсистем.
Есть еще и такие характеристики диагностических тест-систем, как положительная предсказательная значимость (ППЗ) и отрицательная предсказательная значимость (ОПЗ). Чтобы пользоваться данными характеристиками (и это отличает их от приведенных выше
чувствительности и специфичности), необходимо знание реальной распространенности данного инфекционного заболевания в обследуемых популяциях населения.
ППЗ рассчитывают как частоту встречаемости инфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как позитивные:
| |
ОПЗ тест-системы рассчитывают как частоту неинфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как отрицательные:
4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК, СЕКРЕТИРУЮЩИХ ТОТ ИЛИ ИНОЙ ПРОДУКТ, - МЕТОД ELISPOT
Метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot, spot - пятно) был разработан в 1983 г. двумя группами авторов (Sedgwick J.D., Holt P.G., Czerkinsky C.C. et al.) для подсчета числа антителообразующих клеток. ELISPOT пришел на смену знаменитому методу локального гемолиза в агаре Н. Йерне.
Идея метода ELISPOT состоит в использовании культуры клеток in vitro при проведении ловушечного твердофазного иммуноанализа на пористой поверхности (рис. 4.12, см. также цв. вклейку). В настоящее время промышленность выпускает планшеты для культивирования (чаще всего 96-луночные, той же стандартной формы, что и планшеты для ИФА), дно которых покрыто нитроцеллюлозной мембраной. На нитроцеллюлозе сорбируют интересующий антиген, после чего в лунки помещают лимфоциты в полноценной культуральной среде и культивируют их в оптимальных для живых клеток условиях (СО2-инкубатор, оптимальная плотность посадки клеток, все необходимые метаболические добавки и т.д.). Через несколько часов или
Рис. 4.12. Общий принцип метода ELISPOT для определения количества клеток, секретирующих цитокины
1, 2, 3 сут (условия подбирают опытным путем) клетки тщательно вымывают из лунок в проточной системе физраствором или водой с детергентом (например, 0,1% Tween-20 или др.).
Если какие-то клетки секретировали антитела против антигена, сорбированного на дне, то на этом дне фиксируются иммунные комплексы «антиген-антитело». Затем добавляют антииммуноглобулиновый конъюгат с ферментом, инкубируют, промывают, добавляют бесцветный субстрат. Фермент, остающийся после промывок только в точках, в которых лежали во время культивирования антителообразующие клетки (пористая поверхность не позволяет клеткам «кататься» по дну лунок), катализирует образование цветного продукта. В результате на дне лунок образуются окрашенные пятна в тех точках, над которыми лежали антителообразующие клетки (АОК). Первоначально пятна пытались подсчитывать визуально. Получали нечеткие субъективные результаты. Вскоре разработали несложное приборное оборудование, состоящее из миниатюрной видеокамеры, которая фиксирует изображение каждой лунки планшета и в цифровом виде отправляет эту информацию в компьютер. С помощью специально созданного программного обеспечения (самый дорогостоящий компонент метода) стали проводить анализ данных, сравнивая опытные лунки с контрольными и определяя количество искомых клеток на (например) 106 общего числа клеток в исследуемой суспензии.
| |
Вскоре стало очевидно: метод ELISPOT весьма универсален и пригоден для под-
счета, скажем, клеток, продуцирующих тот или иной цитокин. В данном случае первым слоем на дно специальных планшетов для ELISPOT сорбируют моноклональные антитела против интересующего цитокина. Затем помещают в лунки культуру исследуемых клеток. Специфическим и творческим моментом в данном случае является добавление в культуру стимуляторов продукции заданного цитокина. Дальнейшие этапы выполнения метода те же, что при подсчете АОК.
Метод ELISPOT, несмотря на весьма высокие цены на реагенты и приборы, включен в международные протоколы обязательных исследований при разработках и клинических испытаниях вакцин. Мы приведем в качестве примера более подробный протокол методики с применением для повышения чувствительности авидин-биотиновой системы. Методика в целом включает два этапа:
1-й - стерильное культивирование живых и функционирующих
клеток;
2-й - иммуноанализ в тех же планшетах, но уже в нестерильных условиях.
Стерильные условия работы
1. Антицитокиновое антитело-1 сорбируют на пористой твердой фазе культурального планшета (это антитело - ловушка для секретируемого цитокина).
2. В планшет помещают исследуемые клетки (суспензию в различных концентрациях - от 105 до 2х106 в 1 мл).
3. К клеткам добавляют стимулятор в различных концентрациях.
4. Систему культивируют в оптимальных условиях в течение 2-24 ч или больше (подбирают оптимум).
Нестерильные условия работы
1. Лунки тщательно промывают сначала водой с целью удаления клеток, затем отмывочным буфером с детергентом (0,1% Tween-20), чтобы смыть все, что плохо связалось.
2. В лунки вносят конъюгат проявляющего антитела-2 с биотином, инкубируют 2 ч.
3. Промывают и вносят конъюгат «авидин-пероксидаза», инкубируют 1 ч.
| |
4. Промывают и вносят субстратную смесь - АЕС [3-амино-9- этилкарбазол, растворенный исходно в N,N-диметилформамиде (100 мг АЕС на 10 мл DMF) и разбавленный до конечной концентрации в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5 и плюс перекись водорода; рецепт
субстратной смеси: 333,3 мкл матричного раствора АЕС + 10 мл ацетатного буфера + 5 мкл 30% перекиси водорода].
5. Реакцию останавливают под визуальным контролем через 5-50 мин путем промывки плэйтов водой.
6. Плэйты сушат при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч.
7. Регистрируют результат, т.е. подсчитывают пятна: либо «вручную», под соответствующим микроскопом (результаты получают в «двоичной системе» - «много» или «мало»), либо в специальном аппарате, считывающем картину дна лунок видеокамерой и соответствующей компьютерной программой анализа пятен (получают цифровой результат).
Результаты, получаемые в ELISPOT, отражены на рис. 4.13 (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.13. Примеры результатов ELISPOT: увеличенное изображение двух лунок: лунки с положительным результатом (а), с четко различимыми «пятнами», подлежащими подсчету; лунки с отрицательным результатом (б)
4.5. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ И ЯДЕРНЫХ БЕЛКОВ - ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ, СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛ И ДРУГИХ
Методы твердофазных иммуноанализов типа ELISA используют и для изучения молекулярных процессов проведения сигналов от мембранных рецепторов внутрь клетки. Эксперименты такого типа состоят из двух этапов.
Творческий поисковый этап - создание модели активации определенных живых клеток in vivo или в культуре in vitro.
Технический этап:
а) лизис клеток без денатурации макромолекул;
б) детекция искомых молекул передачи сигналов методом ловушечного ИФА.
| |
В качестве «ловушки» на твердой фазе используют высокоспецифичные антитела к определенным эпитопам, характерным для активированного состояния молекул, например сайтам фосфорилирования конкретных белков, участвующих в проведении сигнала. В этой связи коммерческие тест-системы такого назначения получили название «phosphoELISA».
Внутриклеточные белки исследуют в целях анализа конкретных молекулярных путей проведения сигналов в клетке (англ. pathways - путь), определяя конкретные киназы, фосфатазы, адаптерные белки, факторы транскрипции и др.
Для исследования внутриклеточных цитоплазматических белков и их производных интересующие клетки тщательно отмывают от внеклеточных субстанций 2-3-кратным центрифугированием (800 g, 5-6 мин) в фосфатном солевом буферном растворе, после чего лизируют буфером следующего состава (одного из возможных): 50 mM Tris, pH 7,4; 250 mM NaCl; 5 mM EDTA (этилендиаминтетраацетат); 1% NP40 (Nonidet P40); 50 mM NaF; 1mM Na3VO4; 1 mM PMSF (ингибитор сериновых протеаз - трипсина и химотрипсина - фенилметан-сульфонил флюорид, матричный 0,3 М раствор в ДМСО, добавляют ex temporo); смесь ингибиторов протеаз (AEBSF, пепстатин А, Е-64, бестатин, лейпептин, апротинин или других, добавляют ex temporo).
Осадок отмытых фосфатным буфером клеток ресуспендируют в лизирующем буфере и оставляют на 15 мин в условиях мягкого перемешивания. Затем лизат центрифугируют при 14 000 об/мин в течение 10 мин, разливают по аликвотам, определяют в нем общую концентрацию белков (чаще всего - методом Bradford). Наиболее приемлемы для дальнейших анализов концентрации белков 200- 400 мкг/мл.
В дальнейшем выполняют обычный ловушечный вариант ELISA (см. выше). Весьма важен как можно более многосторонний контроль (как минимум заведомо положительный контроль, заведомо отрицательный контроль, а также лизат одноименных, но неактивированных клеток, лизат клеток, обработанных «посторонним» биохимически родственным активатору веществом и др.).
| |
Определение факторов транскрипции во внутриядерном содержимом
Процедура получения фракции ядер интересующих клеток может быть следующей.
1. 5х106-2х107 клеток помещают в коническую пробирку объемом 15 мл, дважды отмывают в 10 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) при 800 g 5-6 мин.
2. Супернатант удаляют и к осадку клеток добавляют гипотонический лизирующий буфер из расчета 0,5 мл буфера на 5х106 клеток. Ex temporo (не ранее, чем за 10 мин до добавления к клеткам) на 0,5 мл гипотонического буфера добавляют 5 мкл ингибиторов фосфатаз, 5 мкл ингибиторов протеаз, 5 мкл DTT (дитиотреитол), 0,5 мкл
PMSF.
3. Клетки аккуратно перемешивают в гипотоническом буфере, переносят в чистую пробирку объемом 1,5 мл и оставляют на льду в течение 10 мин.
4. Добавляют 25 мкл на 0,5 мл рабочего материала раствора детергента (0,1% SDS; 1% Triton X-100; 0,1% Tween 20) и перемешивают в течение 5 с.
5. Центрифугируют при 800 g 5-6 мин, 4 °С.
6. Супернатант отделяют (он содержит цитоплазматические белки и может представлять интерес для отдельного анализа), а осадок ядер ресуспендируют в 1 мл полного буфера для отмывки ядер (к буферу добавляют ex temporo 10 мкл ингибиторов фосфатаз, 10 мкл ингибиторов протеаз, 10 мкл раствора DTT, 1 мкл раствора PMSF).
7. Ядра дважды отмывают центрифугированием при 800 g 5-6 мин, 4 °С.
8. Осадок ядер по объему примерно равен 25 мкл. К этому осадку добавляют равный объем специальных экстрагирующих буферов и аккуратно перемешивают в течение 2 с.
9. Смесь инкубируют на льду в течение 30 мин, перемешивая каждые 10 мин.
10. Осветляют ядерный экстракт центрифугированием при 14 000 g 30 мин при 4 °С.
11. Супернатант содержит искомые вещества (факторы транскрипции). Его переносят в чистые охлажденные пробирки.
| |
12. Определяют концентрацию белков по Bredford. Как правило, из 5х106 клеток удается получить 25-100 мкг ядерных белков.
13. Полученные образцы можно морозить при -80 °С в ожидании анализа, но только однократно.
Существуют технологии одновременного определения в одном биоматериале нескольких искомых факторов транскрипции (или цитокинов, или киназ и др.). Подобные методы в настоящее время осуществимы главным образом с применением высокотехнологичных коммерческих тест-систем. В качестве примера мы приведем описание процедур для тест-системы «Luminex 100» (Invitrogen. www.invitrogen.com). В данной технологии в качестве твердой фазы для ключевых реагентов используют микрошарики. Оценка результатов возможна только на уникальном приборе (большинство подобных тест-систем - так называемые закрытые, т.е. используют только свои приборы, свои реагенты, свои компьютерные программы).
Факторы транскрипции по своей природе реагируют, т.е. специфически связываются с определенными последовательностями нуклеотидов в двуспиральной ДНК.
Поэтому специфическими реагентами на факторы транскрипции являются строго определенные олигонуклеотиды ДНК, меченные биотином.
Второй олигонуклеотидный реагент конструируют из двух частей. Первая - последовательность нуклеотидов, комплементарная меченному биотином олигонуклеотиду. В виде двойной спирали они составляют сайт связывания искомого фактора транскрипции. Вторая часть этого олигонуклеотида - «ловушечная» последовательность, комплементарная последовательности нуклеотидов, фиксированной на твердой фазе (микрошариках).
Пробы раскапывают в лунки микропланшет, предназначенных для проведения ПЦР, чтобы использовать для инкубаций в качестве термостата термоциклер.
| |
Минимальный набор анализируемых образцов включает:
• заведомо позитивный контроль;
• заведомо негативный контроль;
• пробу в виде постороннего белка;
• ядерный экстракт из нестимулированных клеток;
• ядерный экстракт из одноименных стимулированных клеток. Такой планшет инкубируют в течение 20 мин при 25 °С (можно в
ПЦР-термоциклере, который в данном случае используют как удобный динамичный термостат).
Затем в лунки с позитивным контрольным реагентом добавляют только буфер, тогда как в остальные лунки вносят буфер с нуклеазой, расщепляющей не связанную с белками ДНК. Инкубируют 20 мин при 37 °С. Только те ДНК-пробы, с которыми связались факторы транскрипции, не расщепляются нуклеазой, так как факторы транскрипции защищают последовательность нуклеотидов от атаки нуклеазы. Таким образом, количество биотиновой метки на молекулах ДНК прямо коррелирует с количеством того или иного фактора транскрипции в биопробе.
Стадия гибридизации с твердой фазой: в лунки вносят реагентные микрошарики и инкубируют 45 мин при комнатной температуре под светонепроницаемой крышкой, например, из алюминиевой фольги (рис. 4.14).
Рис. 4.14. Связывание с твердой фазой (шариками)
На следующей стадии (отмывке) применяют специальные планшеты из фильтрующего материала: содержимое лунок первоначальных планшет переносят в лунки планшет из фильтрующего материала и промывают трижды промывочным буфером с использованием вакуумной аспирации; растворимые компоненты вымываются, микрошарики остаются на дне лунок фильтровальных планшет.
Добавляют проявляющий реагент - конъюгат стрептавидина с люминофором, инкубируют 5 мин в темноте (рис. 4.15). Промывают и регистрируют люминесценцию на специальном приборе (например, Luminex 100).
| |
Результаты считывают и обрабатывают специальной компьютерной программой (Luminex IS и др.).
В каждой биопробе за один цикл анализа, т.е. одновременно, можно количественно определить до 10 факторов транскрипции и более.
Рис. 4.15. Проявка
Вопросы и задания
1. Дайте определение термина «иммуноанализы».
2. Назовите варианты меток.
3. Назовите технологические варианты иммуноанализов.
4. Что такое «прямые» иммуноанализы?
5. Что такое «непрямые» иммуноанализы?
6. Какие вам известны варианты конструкций тест-систем?
7. Какие ферменты используют в иммуноферментных анализах?
8. Что такое иммунохроматография?
9. Что такое иммуноблот?
10. Дайте определение чувствительности и специфичности тестсистем.
11. Тест-системы с какими чувствительностью и специфичностью (высокой/низкой) следует применять в скрининговых (первичных) обследованиях?
12. Как зависит величина сигнала от концентрации определяемого вещества в биопробе в:
а) ловушечном;
б) конкурентном;
в) ингибиторном;
г) «сэндвич»;
д) иммунометрическом вариантах иммуноанализов.
13. Нарисуйте схему иммунометрической тест-системы.
14. Что означает вывод о «ложнопозитивном» результате иммуноанализа?
15. Что означает вывод о «ложнонегативном» результате иммуноанализа?
16. Какие варианты регистрирующих приборов применяют в иммуноанализах?
17. Какова в среднем чувствительность иммуноанализов (относительно концентраций определяемых веществ)?