Практикум учеб пособие Ковальчук Л. В. и др. 2010. 176 с ил
 Скачать 4.21 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
 С этим файлом связано 51 файл(ов). Среди них: Degtyarev_Gastroenterologia.pdf, Levontin_Chelovecheskaya_individualnost.pdf, Uchebnik_N_N_Alipov_Osnovy_meditsinskoy_fiziolo.pdf, 5.png?extra=7lw9h4cikwtBS2A8fENdISxnlBrFPL4oa1md5g_xkqCFZwE__jbl, 19_Metody_profilaktiki_nasl_bolezney.docx, legionellez2009.pdf, Patologia_pecheni.doc, Normalnaya_fiziologia_Agadzhanyan.rar, Sablin_O_A__Grinevich_V_B_-_Funktsionalnaya_dia.pdf и ещё 41 файл(а). Показать все связанные файлыГлава 4 Иммуноанализы
Порядок постановки реакции следующий. 1. Агар растворяют в физиологическом растворе при 56 °С (температура расплавления агара). 2. В виде золя агар выливают на плоское стекло. При охлаждении до комнатной температуры агар застывает в гель. 3. В застывшем геле пробивают трубочкой-пробойником правильные круглые отверстия (лунки) небольшого диаметра (2-3 мм). 4. В эти лунки вносят образцы антисыворотки и растворы антигенов. 5. Оставляют на диффузию в течение 16-24 ч, по истечении которых можно наблюдать полосы преципитации, если в исследуемых образцах присутствовали комплементарные друг другу лиганды. Метод Оухтерлони и Элека иллюстрирует рис. 4.1. (см. также цв. вклейку). Рис. 4.1. Метод Оухтерлони и Элека: а - линии преципитации, при диффузии двух одинаковых антигенов (АГ) навстречу антителам (АТ), плавно сливающиеся друг с другом; б - линии преципитации, при диффузии двух разных антигенов навстречу антителам, не сливающиеся, а пересекающиеся между собой, «не замечающие» друг друга Радиальная иммунодиффузия по Манчини В 1965 г. Джульетта Манчини и соавт., а независимо от них - Д.Л. Фэй и Э.М. МакКелви разработали методику радиальной иммунодиффузии (РИД) в том же агаровом геле для количественного определения содержания в крови (в сыворотке) иммуноглобулинов классов А, G и М. Для этого потребовалось получить моноспецифические антисыворотки лабораторных животных против очищенных иммуноглобулинов классов М, А и G человека. Моноклональных антител в те годы еще не было. Манчини, Фэй и МакКелви воспользовались тем физикохимическим свойством агар-агара, что температура его плавления недалека от физиологических температур теплокровных животных, и белки (по крайней мере иммуноглобулины) не претерпевают калечащую денатурацию при температуре плавления агара. Это позволило авторам ввести в состав золя агара, т.е. в жидкую фазу, антисыворотки против иммуноглобулинов разных изотипов, тщательно перемешать раствор перед заливанием на стеклянную пластину. Таким образом, в слое агарового геля оказываются заплавленными антииммуноглобулиновые антиизотипические антитела. В таком геле пробивают круглые луночки, в которые вносят так называемые стандарты (или калибраторы, т.е. растворы иммуноглобулинов с известной концентрацией для построения калибровочной кривой) и пробы испытуемых сывороток и оставляют на свободную диффузию на 16-24 ч.
По истечении этого времени вокруг луночек образуются видимые невооруженным глазом кольца преципитатов. Опыт показал: диаметр колец преципитатов тем больше, чем выше концентрация данного изотипа иммуноглобулинов в исследуемой биопробе. Калибраторы - препараты иммуноглобулинов заданного изотипа с известной весовой концентрацией (мг/мл) - позволяют построить калибровочную кривую и с ее помощью определить концентрации иммуноглобулинов в испытуемых пробах сывороток. Последнее возможно только на прямом отрезке кривой. Для спрямления калибровочной кривой прибегают к несложным математическим действиям, например откладывают на осях координат не диаметр колец преципитации, а квадрат этой величины, и/или не концентрацию изотипа иммуноглобулинов, а логарифм концентрации по основанию 2 или 10. Какой подход окажется приемлемым, подбирают опытным путем в каждой лаборатории. Хотя метод РИД разработан полвека назад, его нередко используют в лабораториях клинической иммунологии до настоящего времени в силу простоты исполнения, относительно невысокой стоимости реагентов и независимости от приборов. Метод РИД применим только для названных изотипов иммуноглобулинов (М, А и G), ибо их физиологические концентрации в сыворотках крови попадают в пределы чувствительности метода (мг/мл). Изотипы IgD и IgE присутствуют в нормальных сыворотках в таких низких концентрациях, которые метод РИД не «видит». Концентрации IgE определяют с помощью высокочувствительных вариантов иммуноферментного анализа - ИФА (см. ниже): 1) общий IgE - ловушечным ИФА, в котором первым слоем на твердой фазе сорбированы моноклональные антиизотипические анти-ε-антитела; 2) для определения антигенспецифичных IgE антигены сорбируют на пористой твердой фазе, где площадь сорбции существенно превосходит дно планшета при одном и том же реакционном объеме; чувствительность определения соответственно существенно выше.
IgD в норме присутствует в сыворотках в следовых количествах, и задача его измерения встает крайне редко (вероятно, только в случаях IgD-продуцирующих плазмоцитом). В табл. 4.1 и 4.2 приведены нормальные концентрации иммуноглобулинов разных изотипов у людей разного возраста (по данным более современного нефелометрического определения с использованием антиизотипических моноклональных антител и прибора нефелометра). Таблица 4.1. Концентрации иммуноглобулинов классов М, А и G в сыворотке крови человека в норме Окончание табл. 4.1 Таблица 4.2. Концентрация изотипов IgG (1, 2, 3, 4), IgA (1, 2) и IgE в сыворотке крови взрослого человека в норме Поскольку IgE в норме в крови присутствует в низкой концентрации, то для снижения вероятности ошибок при записывании нулей по международной договоренности значения IgE выражают в так называемых международных единицах - МЕ/мл или кМЕ/л (IU/ml, kIU/l). 1 МЕ равна 2,43 нг IgE. Лабораторная работа 4-1 Определение уровня IgМ, IgA и IgG в сыворотке человека методом радиальной иммунодиффузии 1. Готовят 1,25-1,5% раствор агар-агара (или синтетической агарозы) в 0,1 М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 (на 1 л воды берут 0,8 г веронала и 4,5 г мединала). Навеску агара (агарозы) заливают буфером и нагревают на водяной бане при 56 °С до полного растворения полимера. 2. В раствор агара добавляют рассчитанное количество (расчет производят, исходя из данных, приведенных в листовке-вкладыше к коммерческим реагентам) антиизотипической антисыворотки, быстро и тщательно перемешивают. Каждый вариант антиизотипической антисыворотки добавляют в отдельную пробирку с раствором агара (агарозы). 3. Раствор смеси агара (агарозы) с антиизотипической сывороткой быстро выливают на подготовленные обезжиренные стеклянные пластины и кладут их на горизонтальный предметный столик для ровного затвердевания агара/агарозы в гель. Гель прозрачен и бесцветен. На стандартное предметное стекло для микроскопических препаратов (площадью 1875 мм2) требуется примерно 3,2 мл смеси раствора агара с антисывороткой.
4. В геле, подложив под стекло с гелем трафарет, специальной трубочкой-пробойником диаметром 2-3 мм делают два (или больше, что зависит от размеров стекол и количества испытуемых биопроб) ряда лунок. Расстояния между центрами лунок - порядка 1,5 см. 5. Заранее рассчитывают и подготавливают растворы калибровочных иммуноглобулинов (иногда называемые стандартами) в трех известных концентрациях. 6. В три лунки (диаметром 2 мм) заливают автоматической пипеткой (дозатором) по 5 мкл калибровочных растворов иммуноглобулинов, в остальные лунки - также по 5 мкл - заливают испытуемые сыворотки. 7. Стекла помещают во влажную, плотно закрываемую посуду и выдерживают в холодильнике при +4 °С 24-48 ч. За это время происходит спонтанная диффузия белков из лунок в гель и образование преципитатов между иммуноглобулинами, содержащимися в испытуемых сыворотках, и антиглобулиновыми антиизотипическими антителами, содержащимися в агаровом геле. Поскольку диффузия свободно идет во всех направлениях, преципитаты имеют форму правильных колец. Преципитаты видны невооруженным глазом, и диаметры колец измеряют в миллиметрах. 8. Для снижения фона образования неспецифических преципитатов пластины можно отмывать раствором с высокой ионной силой - 5% NaCl: в течение 48-72 ч промывочный раствор меняют несколько раз. 9. Если задачи работы требуют долгосрочного хранения препаратов, то гель на стеклах с преципитатами фиксируют и красят анилиновыми красителями, прокрашивающими белки, например кумасси-голубым (на 1 г сухого красителя - 50 мл ледяной уксусной кислоты и 150 мл воды). Окрашенные препараты с кольцами преципитатов промывают и высушивают. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая показаны на рис. 4.2 (см. также цв. вклейку).
Рис. 4.2. Внешний вид стекол с результатами РИД и калибровочная кривая Иммуноэлектрофорез В те же 40-е гг. XX в. биохимики научились проводить электрофоретическое разделение белков в гелевых средах. В 1953 г. П. Грабар и К. Уиллиамс (P. Grabar, C.S. Williams) предложили методику иммуноэлектрофореза, которая фактически представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белковых смесей и метода Оухтерлони и Элека. В геле с одного края пластины пробивают ряд из несколько лунок, в которые вносят исследуемые на содержание тех или иных интересующих белков растворы или сыворотки пациентов. К пластине с гелем прикладывают электрическое поле и проводят электрофорез. По завершении электрофореза в геле в центре пластины вырезают канавку, параллельную направлению движения белков в электрическом поле. В эту канавку вносят антисыворотку или смесь антител против искомых белков и оставляют на 16-24 ч для диффузии, после чего регистрируют образующиеся полосы преципитации. Число полос преципитации показывает, к какому количеству компонентов, находящихся в биопробе, в антисыворотке есть комплементарные антитела. Если при электрофорезе использовать калибраторы, т.е. известные белки в достаточных концентрациях, то сравнение полос преципитации материала из биопроб с полосами преципитации с калибровочными белками может стать доказательством наличия в испытуемом материале конкретного белка(ов). Существует множество модификаций метода иммуноэлектрофореза. На рис. 4.3 проиллюстрировн наиболее простой и употребляемый вариант. Рис. 4.3. Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уиллиамсу: а - схема установки; б - результаты электрофореза В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов - 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков - альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов. После диффузии сыворотки-1 видны дуги преципитации со всеми основными фракциями сывороточных белков, в том числе с иммуноглобулинами. В сыворотке пациента 2 гамма-глобулины отсутствуют. На основании данных электрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии.
«Ракетный» иммуноэлектрофорез Если к гелю на стеклах, полностью подготовленных для выполнения метода радиальной иммунодиффузии, приложить электрическое поле, то движение компонентов сывороток, в том числе иммуноглобулинов, из лунок в толщу геля будет происходить не в режиме спонтанной диффузии, а в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля, что существенно ускоряет процесс. В результате преципитаты станут видны уже примерно через 1 ч, но будут иметь форму не колец, а вытянутых пиков, напоминающих летательные аппараты - ракеты. Такую модификацию метода иммунодиффузии называют «ракетным» иммуноэлектрофорезом. Внешний вид результатов «ракетного» иммуноэлектрофореза показан на рис. 4.4. Рис. 4.4. «Ракетный» иммуноэлектрофорез: 1 - пациент с агаммаглобулинемией; 2, 3, 4 - калибровочные растворы иммуноглобулинов; 5 - пациент с гипергаммаглобулинемией (возможна миеломная болезнь) В настоящее время во многих лабораториях изотипы иммуноглобулинов определяют нефелометрическим методом. Специфическими реагентами служат моноклональные антиизотипические антитела. Количество иммунных комплексов оценивают на приборе нефелометре. Калибровку и расчет результатов осуществляют с помощью программного обеспечения. 4.2. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ И РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗЫ В основе самых распространенных на сегодня методов иммуноанализов, базирующихся на количественном определении растворимых веществ, лежит взаимодействие антигена с антителом (т.е. иммунологическое распознавание), которое детектируется (визуализуется) с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с антителом, либо с антигеном. В качестве меток используют вещества, которые при определенных условиях тот или иной прибор может «увидеть» (зарегистрировать) и измерить количество метки. Физико-химическая чувствительность таких анализов обычно составляет нанограммы на миллиметр, но, применяя конкретные тест-системы, нередко выявляют пико- и фемтомоли определяемого вещества.
Варианты меток и материалов для твердой фазы Метки 1. Радионуклид используется при радиоиммунном анализе (РИА). 2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. В данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность - анализ иммуноферментно-флюоресцентный. 3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др. В случае РИА результат измеряют на счетчиках радиоактивности в зависимости от того, какие частицы/кванты излучает конкретная метка-радионуклид. Результаты РИА нельзя зарегистрировать без соответствующих приборов. В случае ИФА при образовании цветного продукта результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего оптическую плотность. Без прибора, на глаз, реакцию можно оценить приблизительно как положительную или отрицательную. При использовании в качестве метки фермента, катализирующего образование флюоресцирующего продукта, результат реакции определяют на флюориметре, измеряющем излучение в определенном диапазоне длин волн. Без прибора в данном случае не обойтись. Впервые методы РИА были разработаны в 1958 г. С. Берсоном и Р. Ялоу. Последняя удостоена в 1977 г. Нобелевской премии за РИА, позволившего впервые в мире определять нанограммовые концентрации пептидных гормонов в крови человека. Менее чем через год после описания РИА в качестве метки стали использовать ферменты с бесцветными субстратами, но окрашенными продуктами. Метод назвали ИФА. По чувствительности и специфичности РИА и ИФА одинаковы, так как их показатели определяются в большей мере аффинностью взаимодействия антитела и антигена, а не типом метки. Однако ИФА применяют много чаще, чем РИА, ибо реагенты для ИФА существенно дольше остаются стабильными, а следовательно, технологию ИФА проще стандартизировать. В РИА используют непрерывно излучающие радионуклиды, и величина их удельной радиоактивности непрерывно же изменяется. Для мечения белков применяют радионуклиды йода (131I или 125I; γ-излучение), у которых период полураспада весьма короток, и реагенты необходимо обновлять примерно раз в месяц.
Сначала иммуноанализы разрабатывали в так называемых гомогенных вариантах (без разделения компонентов в растворе). Но вскоре в технологии иммуноанализов начали использовать твердую фазу, на которой методом спонтанной сорбции из раствора фиксируется антиген или антитело. Анализы стали называть твердофазными, или иммуносорбентными (англ. ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay). Технологически твердофазные анализы несравнимо удобнее гомогенных тестов. В настоящее время твердофазные варианты ИФА применяют в 99,9% тест-систем. В качестве «твердой фазы» используют следующие материалы: 1) пластмассу (полистирол, поливинилхлорид и др.) в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и прочее - для постановки единичных проб); 2) пористые материалы типа нитроцеллюлозы в виде наполнителей в объеме или в виде плоских листов или полосок стрипов (англ. strip); стрипы используют в методиках типа иммуноблота и иммунохроматографии; в пористых материалах существенно больше площадь, на которой сорбирован один из участников взаимодействия; другие реагенты диффундируют по порам. Принцип иммуносорбентных анализов заключается в том, что на материале твердой фазы в соответствии с физико-химическими свойствами сорбируется антиген или антитело. Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА/РИА пластмассовых материалах. Если заданный антиген в силу своей химической природы (липид, углевод, липоили гликопроизводные белков) плохо сорбируется на выбранной твердой фазе, то подбирают вещество-«подложку», которое с одной стороны хорошо свяжется с твердой фазой, с другой стороны - с антигеном. Однако потребность в «подложке» возникает крайне редко. Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов. Их добавляют к твердой фазе поочередно, инкубируют, после чего несвязавшиеся реагенты легко удаляют промывкой твердой фазы. В этом главное технологическое преимущество твердофазного иммуноанализа. Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно.
Существует много вариантов конструкций тест-систем для иммуноанализов. Мы разберем несколько базисных и более подробно объясним значения терминов. | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |