Главная страница
qrcode

Феномен преципитации


Скачать 74.04 Kb.
НазваниеФеномен преципитации
АнкорФеномен преципитации микроба.docx
Дата23.10.2016
Размер74.04 Kb.
Формат файлаdocx
Имя файлаFenomen_pretsipitatsii_mikroba.docx
ТипДокументы
#404
Каталог

Феномен преципитации. Основан на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в жидкой фазе или в геле. Это приводит к образованию мелкодисперсного агрегата (преципитата).

К методам образования преципитата в жидкой фазе относятся реакции: пробирочная Крауса, кольцепреципитации Асколи, капилярной преципитации, флокуляции и различные осадочные реакции (Кана, Закс-Витебского и пр.).

Метод, основанный на взаимодействии растворимых молекул антигена и антител в геле, по принципу диффузии компонентов, составляют реакции: простая одномерная и двумерная диффузия, радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектрофорез и его модификации.

Феномен преципитации

Это взаимодействие растворимых антигенов и антител с образованием агрегатов, что проявляется помутнением среды (образованием преципитата).

Осадочный метод.

Это реакции преципитации в растворе электролита, с медленно осаждающимся осадком (преципитатом).

РКПА - реакция кольцепреципитации Асколи.

Иммунную сыворотку в небольших разведениях (1:2-1:10) наливают в коническую пробирку в количестве 3-5 мл. По стенке этой пробирки пастеровской пипеткой осторожно наслаивают на сыворотку равный объем растворимого антигена (экстракт микробов). Для разведения ингредиентов применяют 0,85 % раствор хлорида натрия.

При наличии в материале антигена на месте встречи двух компонентов через несколько минут появляется помутнение - беловатое кольцо преципитата. Если антигена нет, то не будет и преципитата.

Эту реакцию широко применяют при определении сибиреязвенных бактерий на кожевенно-меховых изделиях. Кусочки кожи с мехом выстригают, измельчают, заливают растворителем 1:10 и кипятят 30 мин. Экстракт используют в РКПА для определения термоустойчивого сибиреязвенного антигена.

Диффузионный метод.

Эта группа реакций преципитации ставится в агаровом геле, результат взаимодействия растворимых антигена и антител проявляется в виде беловатой полоски на границе их встречи в геле - преципитат.

РПГ - реакция преципитация в геле.

Реакцию ставят на чашках Петри, залитых пептонным агаровым слоем. Посередине помещают полоску фильтровальной бумаги, предварительно смоченной антитоксической сывороткой. После подсушивания, на расстоянии 1 см от края полоски делают посевы культур дифтерийного микроба бляшками до 1 см, с двух сторон полоски бумаги. Среди культур должен быть заведомо токсигенный штамм (положительный контроль) и штамм нетоксигенный (контроль отрицательный). Посевы помещают в термостат на 24 ч.

Если культуры были токсигенные, то между полоской бумаги и бляшкой культуры возникает белая линия преципитации, которая совпадает с линией преципитации положительного штамма. Если культуры не токсигенные, то линии преципитации не будет. Преципитат образуется благодаря диффузии антител и антигена в разные стороны в агаре. В месте их встречи появится белая полоска преципитации.

РПО - реакция преципитации по Оухтерлоне.

Еще одна разновидность преципитации в геле. В агаре на чашке Петри определенными пробойниками вырезают 4 небольшие лунки, расположенных в виде квадрата, на расстоянии 0,5 см. В первую лунку вносят иммунную сыворотку. Во вторую лунку рядом - известный антиген (контроль положительный), гомологичный иммунной сыворотке, которая в 1 лунке. В третью лунку, напротив первой лунки, вносят нормальную сыворотку (отрицательный контроль). В 4 лунку, рядом с первой, но с другой стороны от нее по сравнению со второй лункой, вносят испытуемый на антиген экстракт. Чашка ставится во влажную камеру на сутки при 37о С - при необходимости и более суток.

Если в испытуемом экстракте присутствует антиген, то полоски преципитации в геле распределятся между 1 и 2 лунками (контроль), 1 и 4 лунками (опыт) под углом к третьей лунке (отрицательный контроль). Если антигена нет, то будет всего одна полоска между 1 и 2 лунками (положительный контроль).

Реакция преципитации характеризуется осаждением специфических мелкодисперсных антигенов эквивалентным количеством антител в присутствии электролита. Выпадение нерастворимого комплекса антиген — антитело в виде осадка наблюдается лишь при эквивалентных соотношениях ингредиентов. Образовавшийся комплекс может раствориться в избытке антигена или антител. Антиген должен иметь характер прозрачного коллоидного раствора.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний реакция преципитации служит главным образом для выявления или идентификации антигена (преципитиногена) по известной преципитирующей сыворотке, содержащей антитела (преципитины). Для приготовления коллоидных антигенов, участвующих в реакции преципитации, используют различные методы их экстракции из исследуемого материала: физические, химические и биологические.

http://micro-biologi.ru/content/mikro-53.jpg

Иммунофлюоресцентный метод. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфицированных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Иммунофлюоресцентный метод относится к экспресс-диагностике, не уступая другим серологическим реакциям по чувствительности и специфичности 

еакция преципитации. Проводится с прозрачными коллоидными растворимыми антигенами, экстрагированными из патологического материала, объектов внешней среды и чистых культур бактерий. Один из распространенных методов хими-

ческой экстракции антигенов бактерий — получение комплексного антигена по Буавену с помощью гидролиза бактерий трихлоруксусной кислотой. В реакции используются прозрачные диагностические преципитирующие сыворотки с высокими титрами антител. За титр преципитирующей сыворотки принимают то наибольшее разведение антигена, которое при взаимодействии с иммунной сывороткой вызывает образование видимого преципитата — помутнения.

Реакция кольцепреципитации. Ставится в узких пробирках (диаметр 0,5 см), в которые вносят по 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем пастеровской пипеткой медленно, по стенке, держа пробирку в наклонном положении, наслаивают 0,1-0,2 мл раствора антигена. Пробирки осторожно переводят в вертикальное положение. Результаты опыта протоколируют (табл. 17).

http://micro-biologi.ru/content/mikro-55.jpg

Учет реакции производят через 1—2 мин. В случае положительной реакции в первой пробирке на границе между сывороткой и исследуемым антигеном появляется преципитат в виде белого кольца. В остальных (контрольных) пробирках преципитат не образуется 

Реакция преципитации в геле (агаре). Чашки заливают агаром, в котором вырезают несколько луночек на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку вносят сыворотку, содержащую антитела, в остальные — различные испытуемые антигены или один и тот же антиген в различных разведениях. При диффузии реагентов в агаре в зонах оптимальных соотношений на месте встречи антигена и антител образуются мутные полосы —дуги преципитации (рис. 58).

http://micro-biologi.ru/content/mikro-56.jpg

В случае постановки реакции преципитации с различными разведениями антигена можно установить титр преципитиру-ющей сыворотки—максимальное разведение антигена, которое дает преципитацию с данной сывороткой. Одна из разновидностей реакции преципитации в геле позволяет определять токсигенность исследуемых бактерий (например, дифтерийной палочки) с помощью антитоксической сыворотки. Для этого в чашку Петри на питательную среду помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Затем чашку подсушивают в термостате и засевают испытуемыми культурами в виде штрихов, перпендикулярных к полоске бумаги, на расстоянии 0,6-0,8 см от ее края. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Чашки инкубируют при 37°С в течение суток. При наличии токсигенной культуры в месте взаимодействия токсина с антитоксином образуются линии преципитации в виде дуг 
ИфА - иммуноферментный анализ

Основан на конъюгации метки в виде фермента.

Прямой метод.

Метод заключается в непосредственном взаимодействии антигена и антител, когда один из них сорбирован на твердой фазе, а другой мечен ферментом.

В настоящем разделе будет дан новый вариант ИФА, тогда как известные варианты широко описаны в литературе.

ИФАП - иммуноферментный анализ прямой.

В лунки полистироловых планшет, например, Санкт-Петербургского зав. биополимеров или другого производства, вносят растворимый на антиген материал по 0,1 мл в дозе 0,05 мкг на 1 мл и планшет оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Планшет отмывают растворителем (0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 0,2 % твина-20, рН 7,2) от несвязавшегося материала.

Предварительно готовят конъюгат: к раствору глобулина иммунной сыворотки, которая должна быть гомологичной предполагаемому антигену по специфичности, в дозе 5 мг на мл, добавляют равный объем раствора каталазы в дозе 10 мг на мл и 0,1 % от объема смеси 2,5 % глутарового альдегида. Смесь выдерживают 30 мин при 37о С, осаждают глобулин 40 % раствором сульфата аммония, растворяют малым объемом растворителя и освобождаются от солей аммония, пропуская глобулин через колонку с сефадексом G-50. Готовый конъюгат хранят с 0,05 % азида натрия или лиофилизируют.

Во все лунки с материалом вносят конъюгат по 0,1 мл и смесь оставляют на 60 мин, после чего трижды промывают растворителем.

Для проявления взаимодействия антигена с антителом необходимо выявить в лунках каталазу. Для этого, вносят субстрат - перекись водорода (0,015 % по 0,1 мл) и через 15 мин вносят хромоген, для проявления реакции каталазы с субстратом - 1 % раствор перманганата калия. Результат реакции оценивают по появлению окрашивания. Если в исследуемом материале есть антиген, то с ним взаимодействуют антитела, которые мечены ферментом. Добавленная перекись водорода разрушается каталазой на воду и атомарный кислород и вносимый хромоген проявляет эту реакцию - жидкость остается красного цвета. Если антигена не было, то антител также не будет как и каталазы. Перекись водорода остается неразрушенной и добавленный перманганат калия моментально меняет цвет на желтый, сходный с контрольной лункой.

Непрямой метод.

ИФА - иммуноферментный анализ.

Существуем много вариантов постановки ИФА, в том числе - твердофазных, на одном из них мы и остановимся.

В микропланшеты вносят по 0,1 мл раствора известного растворимого антигена в дозе 0,05 мкг на мл. Планшеты оставляют на 24 ч при комнатной температуре, трижды отмывают растворителем.

Делают несколько последовательных разведений исследуемой иммунной сыворотки в пробирках в объеме 0,5 мл, начиная с 1:50. Последней пробиркой является контрольная – без сыворотки. Начиная с контроля, вносят в последнюю лунку планшета 0,1 мл (контроль), в предпоследнюю лунку планшета - 0,1 мл разведения из предпоследней пробирки и т.д. Смесь оставляют на 30 мин при 37о С и затем трижды промывают лунки растворителем. После этого вносят во все лунки видовой конъюгат по 0,1 мл Смесь выдерживают 40 мин при комнатной температуре и трижды промывают растворителем. А затем вносят субстрат и хромоген.

Предварительно делают конъюгат, как описано выше, только в качестве сыворотки берут кроличью антисыворотку к сывороточным белкам человека, которую метят ферментом каталазой (как описано выше). Получаем видовой конъюгат против белков сыворотки людей. Применение такого препарата более выгодно, чем на основе гомологичной иммунной сыворотки к антигену. Такую сыворотку необходимо готовить заново при новом антигене, а видовой конъюгат можно использовать во всех случаях исследования сывороток людей.

Если исследуемая сыворотка содержала антитела, то происходит взаимодействие ее с антигеном и на Fc-фрагмент ее антител прикрепляются антитела из конъюгата (кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека) меченого ферментом. Он разлагает внесенный в лунки субстрат и хромоген (перманганат калия) не изменит своего красного цвета. Если антител в сыворотке исследуемой нет, то не будет и фермента и субстрат будет действовать на хромоген, который мгновенно изменит цвет среды на желтый (таблица № 24).

Таблица № 24.

Схема постановки непрямого варианта ИФА


Лунки планшет

Последовательность процесса постановки непрямого варианта ИФА

антиген

процесс

отмывания

антисы-

воротка

процесс отмывания

конъю-

гат

субстрат

хромоген

резуль-

тат ИФА

Дополнительная характеристика вносимых агентов, в мг или мл

в рабо-чей дозе

фосфатн.

буфер + твин-20

- 1:100 или раствори-тель

то же

на 30 мин

перекись

водорода

на 15 мин

перманга-нат калия


окраска,

момен-

тально

1-я. Опыт

0,05 мл

3 раза

0,025 мл

3 раза

0,05 мл

0,05 мл

0,05 мл

красная

2-я. Контроль

0,05 мл

3 раза

растворитель

по 0,025 мл

3 раза

0,05 мл

0,05 мл

0,05 мл

желтая


Торможение метода.

К этому методу относятся конкурентные пробы, названные так по сути происходящего процесса. Торможение - это конечный эффект реакций.

В лунки микропланшета двух рядов вносят иммунный глобулин известной сыворотки для адсорбции на стенках лунок пластин (24 ч при комнатной температуре, рН 6,0). После экспозиции лунки трижды отмывают растворителем. Затем в лунки двух рядов вносят по 0,1 мл осветленного копроэкстракта, исследуемого пациента. Копроэкстракт был заранее приготовлен в пробирках в 5 последовательных разведениях (как описано выше). После экспозиции 30 мин при 37о С, пластины трижды отмывают растворителем. В первый ряд с экстрактом вносят общим объемом 0,1 мл смесь сывороток: иммунную и эту же иммунную, но меченую каталазой. Во второй ряд - только иммунную сыворотку, меченую ферментом. После экспозиции 30 мин пластину трижды отмывают растворителем.

В оба ряда вносят перекись водорода, а через 15 мин и перманганат калия. Проводят учет реакции по изменению цвета лунок в сравнении с контрольным рядом (второй).

Если в исследуемом материале есть антиген, то в первом ряду произойдет конкуренция за детерминанты между мечеными и немечеными антителами. Результатом этого будет укорочение числа лунок с положительным результатом в первом ряду по сравнению со вторым, где конкуренции не было. Если антигена не было, то положительных лунок не будет ни в первом ряду, ни во втором, т.е. цвет лунок будет желтым.

ИФА считается одним из лучших методов, применяемых в практике, с высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяемые методы ИФА описаны в разделе для визуального учета, хотя существует автоматизация в прочтении результатов и постановке ИФА. При постановке на современной аппаратуре не виден механизм реакции, поэтому упор был сделан на постановку ИФА при визуальном прочтении результатов.

Следует учесть, что на сегодня разработаны новые методы, которые не относятся к иммунологическим, т.е. там нет взаимодействия антител с антигенами, например, зонды ДНК и др. или комбинированный молекулярно-генетический и электрофоретический метод - ПЦР.

ПЦР – полимеразная цепная реакция

Метод предложен американским исследователем Карри Мюллисом (1983), удостоенным в 1993 г Нобелевской премии. Эта реакция носит название репликации ДНК.

Открытие термостабильной Tag-полимеразы (ДНК-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aguaticus, оптимум которой находится в области 70-72о С, позволило делать процесс репликации ДНК циклическим. При этом происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК.

Комплементарное достраивание цепи начинается только в стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Присоединение таких блоков к специфическим участкам ДНК направляет процесс синтеза новой цепи только в этом участке ДНК.

Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК достаточно использовать две олигонуклеотидных затравки (20 нуклеотидных пар), называемых праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

Метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий, называемых амплификации, специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в разных температурных режимах.

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95о С в течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значение которой располагается в интервале 50-65о С. Время отжига 20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК идет от 5’ - конца к 3-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участка присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор gHTФ – дезоксирибонуклеотидтрифосфат. Процесс синтеза новой цепи катализируется ферментом - термостабильной Tag-полимеразой и проходит при температуре 70-72о С. Время синтеза 20-40 сек. Образовавшиеся новые цепи служат матрицами для второго цикла амплификации, в которой происходит образование специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах ампликон служит матрицей для синтеза новых цепей. За 30-40 циклов рабочий раствор накапливает 108 молекул ампликона.

. Исследуемым материалом служат соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка крови, плевральная жидкость и СПЖ, моча, мокрота, слизь и др.

Выделение ДНК из образца. Способ выделения ДНК зависит от вида возбудителя и от клинического образца. В некоторых случаях добавляют лизирующий агент, содержащий раствор гуанидина, сорбции ДНК на сорбенте, многократное отмывание и ресорбция ДНК. В других случаях необходима депротеинизация фенолом или хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом, обработка ведется в микроцентрифужных пробирках типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл. Время обработки 1,5-2 ч.

Проведение ПЦР. Определенное количество образца из обработанной клинической пробы переносят в специальную микроцентрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 0,5 мл. В эту же пробирку добавляют амплификационную смесь, состоящую из воды, ПЦР-буфера, раствора gHTФ, раствора праймеров и раствора Tag-полимеразы (добавляют в последнюю очередь). Объем реакционной смеси составляет 2,5 мкл. В пробирку добавляют одну каплю минерального масла для предотвращения испаренения жидкости. Пробирку переносят в программируемый термостат (амплификатор) и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе, соответствующей виду определенного возбудителя. Время проведения реакции в зависимости от программы составляет 2-3 ч.

Контроль реакции осуществляется одновременной постановкой ПЦР на клиническом материале: положительный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо материала вносят контрольный препарат ДНК. Отрицательный контроль включает все компоненты реакции, а вместо клинического материала вносят соответствующее количество деионизированной воды.

Регистрация результатов. Амплифицированный специфический фрагмент ДНК можно выявить методом электрофореза в 1 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединенеи внедрения, проявляющееся в виде светящихся полосок при облучении геля УФ-лучами с длиной волны 290-330 нм. Для приготовления агарозного геля расплавляют в СВЧ-печи или на водяной бане смесь агарозы, буфера и воды, добавляют раствор бромистого этидия, охлаждают до 50о С смесь тонким слоем заливают в форму и с помощью специальных гребенок делают в геле карманы для нанесения образца. После застывания геля в его карманы наносят амплификат, смешанный с буфером для нанесения образца, содержащего краситель. Гель с нанесенным образцом переносят в камеру для электрофореза, заполненную буфером. Камеру подключают к источнику питания и проводят электрофоретическое разделение продуктов амплификации в течение 30-45 мин. Гель просматривают в УФ-свете с помощью трансиллюминатора, желательно фотографируют. Результат оценивают по наличию в анализируемой пробе ДНК- фрагмента, пятно которого располагается на том же уровне, что и пятно контрольного ДНК- препарата. Такие фрагменты синтезируются при наличии в исследуемом материале клеток соответствующего возбудителя.
перейти в каталог файлов


связь с админом