Общая_микробиологи_учеб._пособие. Учебно-методическое пособие Новосибирск 2016
 Скачать 1.43 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
| 1.3. Оборудование рабочего стола. Микроскопы со светите л ем, вмонтированным в основание, предназначены для изучения морфологии микроорганизмов в окрашенных или нативных препаратах. Спиртовки необходимы для фиксации препаратов, прокаливания бактериологической петли и краев пробирок и колб при открывании последних, а также поверхности ватно-марлевых пробок. Посев культур микроорганизмов на питательные среды производятся также у зажженной спиртовки, чтобы предотвратить попадание посторонних микроорганизмов из воздуха на питательные среды. Набор красителей, используемых для окраски препаратов микроорганизмов. Генцианвиолет – фильтровальные бумажки, пропитанные спиртово- карболовым раствором генцианвиолета (генцианвиолет – 1 г, фенол – 2 г, спирт градусный –100 мл, вода дистиллированная – 100 мл. Карболовый фуксин Циля – фильтрованные бумажки, пропитанные спиртово-карболовым раствором фуксина основного (фуксин основной – 1 г, фенол – 5 г, спирт градусный – 10 мл, глицерин – 3 мл, вода дистиллированная мл. Фуксин Пфейфера – водный раствор карболового фуксина Циля, раз- ведённый дистиллированной водой 1:10. Метиленовый синий – спиртово-водный раствор (краска –1 г, спирт 96- градусный – 10 мл, вода дистиллированная – 100 мл. Метиленовый синий (по Леффлеру) – спиртово-водный раствор метиленового синего с добавлением го водного раствора КОН. Раствор Люголя – йодистый калий – 1 г и йод кристаллический – 2 г, растворённые в дистиллированной воде (300 г. 13 Нейтральный красный (нейтральрот) – й водный раствор этого красителя. Фарфоровая ванночка сост е кл я н н ы мм ости комик о лба свод ой служат для смыва красителей с препарата вовремя его окраски. Масло иммерсионное предназначено для работы с объективом х. Восковой карандаш необходим для написания по стеклу. Салфеткам ат ер ч ат а я средняя предназначена для протирания оптических деталей микроскопа, за исключением иммерсионного объектива. Салфеткам ат ер ч ат а я большая используетсядля предохранения микроскопа от пыли. Салфеткам ар левая малая необходима для снятия масла с иммерсионного объектива после работы. Лист фильтровальной бумаги служит для просушивания препаратов после их окраски. Штатив сна бором культур. Культура определенный вид микроорганизма, выращенный на питательной среде. В штативе находится три пробирки с культурами. Пробирка с культурой кишечной палочки – Escherichia coli, выращенной на плотной питательной среде Эндо красного цвета. Цвет среды обусловлен наличием красителя фуксина. Кишечная палочка является в норме обитателем толстого кишечника всех животных и человека, в природе находится в почве и воде. Является самым изученным организмом на Земле, излюбленным объектом исследования биохимиков, генетических инженеров. Существуют патогенные для человека и животных штаммы кишечной палочки, вызывающие заболевания. Генетически измененная кишечная палочка используется в промышленности для производства несвойственной ей продукции, а именно инсулина, гормона роста человека, интерферона. Пробирка с культурой сенной бациллы – Bacillus subtilis, выращенной на питательной среде МПА (мясопептонном агаре). Пептон – продукт частичного распада белка, агар – водоросль, придающая плотность среде. Сенная бацилла широко распространена в природе на растениях, в сене. Используется в микробиологической промышленности как продуцент ферментов (амилосубтиллина и др) при производстве кормовых добавок для животных. Пробирка с культурой пекарских дрожжей – Saccharomyces cerevisiae, выращенных на жидкой питательной среде с глюкозой. Различные виды дрожжей используются человеком с незапамятных времён для получения хлеба, пива, вина. В условиях микробиологического производства дрожжи нарабатывают микробный белок на сельскохозяйственных отходах, атак- же используются для производства этанола, витаминов, различных ферментов. Дрожжи являются хорошей добавкой к кормам животных за счёт большого содержания белка и незаменимых аминокислот. Кроме культур, в штативе находится пробирка с физиологическим раствором. 14 Пробирка с физиологическим раствором необходима для приготовления мазков-препаратов. Концентрация хлористого натрия этого раствора (0,85%) соответствует осмотическому давлению внутри микробной клетки, поэтому при использовании физиологического раствора не происходит плазмолиза или плазмоптиза микробной клетки, что непременно наблюдалось бы, если бы вместо физиологического раствора был взят гипотонический или гипертонический раствор. 1.4. Техника работы с бактериологической петлёй, пробиркой, спиртовкой Всю основную работу – посев микроорганизмов, взятие культуры для микробиологического исследования – микробиолог осуществляет с помощью бактериологической петли. Каждый раз, перед тем как пользоваться петлёй, а также после её использования, петля должна прокаливаться в пламени спиртовки до покраснения. Петлю держат в правой руке, как карандаш, прогревают её сначала по вертикали, затем горизонтально в верхней части пламени. Особенно тщательно прокаливают место крепления самой петли в петледер- жателе. Микроорганизмы могут культивироваться в пробирках или в чашках Петри на питательных средах. Для того чтобы взять микроорганизмы из пробирки, её подносят левой рукой к пламени спиртовки, а правой, держа бактериологическую петлю, одновременно открывают пробку, прижав её мизинцем к ладони. Прикасаются остывшей петлёй сначала к питательной среде, а затем к штриху, по которому растут микроорганизмы на питательной среде в пробирке, вынимают петлю, не касаясь стенок пробирки. Края её обжигают в пламени спиртовки и закрывают пробкой над пламенем. Микробную массу можно перенести теперь в другую пробирку, со стерильной питательной средой, открыв пробирку точно также в пламени спиртовки. Петлю лёгкими движениями проводят по поверхности среды, как бы рисуя волнообразную линию. Пробирку с вновь посеянными микроорганизмами закрывают в пламени спиртовки, подписывают и ставят в термостат. В том случае, когда культура микроорганизмов выращена в чашке Пет- рис питательной средой, чашку ставят на стол рядом с пламенем спиртовки, левой рукой приподнимают крышку так, чтобы в образовавшееся отверстие свободно проходила петля. Микробную массу захватывают лёгким прикосновением к поверхности питательной среды, чашку закрывают, а микроорганизмы могут быть перенесены в другую пробирку или чашку. Вовремя работы нельзя класть петлю, пробирки, пробки на рабочий стол или в другое место. Они должны находиться в руках исследователя, а после работы обожженная петля ставится в стакан. 15 1.5. Организация работы бактериологической лаборатории по исследованию продовольственного сырья и продуктов Микробиологическая лаборатория для санитарно-бактериологического контроля сырья, готовой продукции, вспомогательных материалов, санитар- но-гигиенического состояния оборудования должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III-IV групп патогенности. Инфраструктура лаборатории соответствует требованиям ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Предусматриваются следующие отдельные рабочие зоны, предназначенные для 1) приема, хранения, подготовки проб 2) проведения первичного посева и других работ в асептических условиях 3) приготовления, стерилизации и розлива питательных сред, подготовки лабораторной посуды 4) обеззараживания отработанных материалов, контаминированных микроорганизмами. Для проверки пищевых продуктов и продовольственного сырья на наличие патогенных микроорганизмов и токсинов при лаборатории должен быть виварий. Для бактериологического анализа колбасных изделий, копченостей необходимы боксы с предбоксниками. Все помещения должны быть снабжены холодными горячим водоснабжением и дезинфицирующими растворами. 1.6. Классификация патогенности микроорганизмов, действующая на территории Российской Федерации В зависимости от патогенности микроорганизмов они разделены на определенные группы, с которыми разрешается работать специалистам, имеющим определенные допуски (Приложение 7 к Инструкции по оценке условий труда при аттестации рабочих мест по условиям труда и предоставлению компенсаций по ее результатам от 22.02.2008 № 35). Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности осуществляется по определенным правилам (Санитарно- эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08, утверждены и введены в действие постановлением Госкомсанэпиднадзора России от 28.08.1995. N: 14). Примерами различных групп патогенности могут быть следующие. К I - II группам патогенности относятся патогенные для человека микроорганизмы (бактерии, вирусы, хламидии, риккетсии, грибы, включая ген- но-инженерно-модифицированные, яды биологического происхождения токсины, а также любые объекты и материалы, включая полевой, клинический, секционный, подозрительные на содержание перечисленных агентов. I группа патогенности – представители бактерии — Yersinia pestis – возбудитель чумы вирусы — возбудители геморрагических лихорадок Filoviridae (Марбург и Эбола) и Arenaviridae (Ласса, Хунин, Мачупо, Себиа, Гуанарито), а также вирусы оспы (Poxviridae) – натуральной оспы человека о и оспы обезьян (Monkeypox). 16 II группа патогенности – представители бактерии Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, Vibrio cholerae О – холеры, Rickettsia typhi – крысиного сыпного тифа, Brucella melitensis и др. виды –- бруцеллеза, Fran- cisella tularensis – туляремии, Burkholderia mallei – сапа, Burkholderia pseu- domallei – мелиоидоза; вирусы –- Flaviviridae – клещевого энцефалита, вирус гепатита С – парентерального гепатита, гепатоцеллюлярной карциномы печени прионы (Unconventional agents) – возбудителигубчатой энцефалопатии крупного рогатого скота хламидии –- Chlamydophila psittaci – возбудители орнитоза-пситтакоза; грибы Blastomyces dermatitidis –- возбудители бластомикоза яды биологического происхождения –- ботулинические токсины – всех типов ботулизма. III группа а) бактерии – возбудители инфекционных болезней коклюша, возвратного тифа, ботулизма, столбняка, дифтерии, листериоза, туберкулеза, дизентерии, сифилиса б) риккетсии –- возбудители марсельской, или средиземноморской, лихорадки в) простейшие – возбудители мочеполового трихомонадоза; г) токсины – стрептококковый токсин группы А, стафилококковые токсины д) вирусы гриппа А, В, С. IV группа микроорганизмов бактерии – возбудители инфекционных болезней энтерита - Aerobacter aerogenes, пищевой токсикоинфекции - Bacilus cereus, абсцессов легких, бактериемии – Bacteroides spp., пищевой токсикоинфекции – Citrobacter spp., газовой гангрены – Clostridium perfringens, энтерита – Escherichia coli, пневмонии – Mycoplasma hominis, пищевой токсикоинфекции, сепсиса, местных воспалительных процессов, сепсиса -– Pseudomonas aeruginosa, сальмонеллезов – Salmonella spp., местных воспалительных процессов, сепсиса – Serratia marcescens, пищевой ток- сикоинфекции, септицемии, пневмонии – Staphylococcus spp., пищевой ток- сикоинфекции – Vibrio parahaemolyticus, энтерита, колита – Yersinia enterocolitica, актиномикоза – Actinomyces albus, вирусы герпеса и ветряной оспы. 17 1.7. Классификация патогенности микроорганизмов Всемирной Организации Здравоохранения Всемирной организацией здравоохранения был предложен свой вариант классификации, однако ВОЗ настоятельно рекомендует использовать ее только для лабораторной работы. Классификация, принятая в США, Канаде, Японии, а также используемая ВОЗ (WHO), отличается от существующей в России обратным порядком микроорганизмы наиболее высокой степени патогенности у них отнесены к й группе. Таб. 1 Таблица 1 Классификация патогенных микроорганизмов Группа риска Характеристика Оценка риска I Отсутствие или низкая индивидуальная и общественная опасность Микроорганизм, потенциально не являющийся возбудителем заболеваний человека или животных II Умеренная индивидуальная опасность, низкая общественная опасность Патогенный микроорганизм, который может вызвать заболевание, ноне представляет серьезного риска для персонала, населения, домашнего скота или окружающей среды. Неосторожность в лаборатории может вызвать инфекцию, однако существуют доступные лечебные и профилактические меры. Риск распространения ограничен III Высокий индивидуальный и низкий общественный риск Патогенный агент, который обычно вызывает серьезное заболевание человека или животных, но, как правило, не распространяется от больного к здоровому. Существуют эффективные лечебно- профилактические процедуры IV Высокий индивидуальный и общественный риск Патогенный агент вызывает обычно серьезное заболевание у человека или животных и легко распространяется от больного к здоровому или опосредованно. Эффективных мер в большинстве случаев не существует В соответствии стем, какие микроорганизмы задействованы в работе, лаборатории классифицируются как базовые – уровень биобезопасности 1, базовые уровень биобезопасности 2, изолированные – уровень биобезопас- ности 3 и максимально изолированные – уровень биобезопасности 4. Классификация лабораторий по уровню биобезопасности производится с учетом их назначения, конструкции, используемого оборудования и средств, практики и оперативных процедур, необходимых для работы с агентами, относящимися к различным группам риска. Для каждой страны (региона) должна быть разработана национальная (региональная) классификация патогенности. 18 Вопросы для самостоятельной работы Правила поведения в микробиологической лаборатории. Оборудование лаборатории. Правила работы со спиртовкой. Техника работы с бактериологической петлёй. Посев культур микроорганизмов. Оборудование рабочего стола. Специфика организации микробиологической лаборатории в целом. 8. Классификация патогенности микроорганизмов, действующая на территории Российской Федерации. Классификация патогенности микроорганизмов Всемирной Организации Здравоохранения. Библиографический список Основной 1. Асонов Н.Р. Микробиология. – е изд, перераб. и доп. – М Колосс. 2. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии М Агропромиздат, 1988. – с. 38. 3. Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – М Высш. шк. 1981. – С. 5-10 4. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М Колос, 1993. Дополнительный 1. Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М Колос, 1993. 2. Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, В.К. Шильникова. – М Агро- промиздат, 1990. 3. Мудрецова – Висс КА Микробиология, санитария и гигиена Учеб. для вузов КА. Мудрецова – Висс, А.А. Кудряшова и др – 7 изд. – М Изд. дом Деловая лит, 2001. 19 Рис. 9. Биологический микроскоп МБИ-2: 1 – косопоставленный бинокулярный тубус 2 – съемное основание тубуса 3 съемный револьвер для четырех объективов 4 – подвижный крестообразный столик микроскопа 5 – основание подвижного столика микроскопа 6 – часть кон- денсорного револьвера 7 – кольцо для установки апертуры конденсора 8 – апертурная шкала 9 – винт для установки апертурной диафрагмы 10 винт для центрирования светового поля 11 – кольцо апертурной диафрагмы 12 – вращающаяся апертурная диафрагма 13 – винт для центрирования крестообразного столика 14 – винт для движения конденсорного устройства 15-16 – макро-и микрометрические винты микроскопа 17 – патрон осветительной лампочки 18 – осно- вание(«ножка») штатива микроскопа МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕТОДЫ ЕЁ ИЗУЧЕНИЯ Тема 1. Микроскоп, его устройство. Техника микроскопирования Микроскоп, его устройство Объектом исследования микробиологов являются чрезвычайно малые организмы, измеряемые микрометрами (1 мкм = 10 мм, а человеческий глаз в силу его физиологических особенностей способен рассмотреть без ка- ких-либо приборов объекты величиной не менее 0,18 мм. Таким образом, микробиологу приходится постоянно работать с микроскопом, чтобы увидеть микроорганизмы и познакомиться с особенностями их строения. Микроскопы (от греч. micros – малый, scopes – смотрю) бывают свето- польные и темнопольные, электронные, люминесцентные, фазово-контрастные и используются в зависимости от конкретных задач, стоящих перед исследователем. Для учебных целей в лабораториях микробиологи используют световой биологический микроскоп, модель МБИ-1, который состоит из механической и оптической частей, для рассмотрения объекта употребляют видимый свет с длиной волны – 0,5 мкм рис. 9). Кроме бинокулярных, исполь- зуютс и тринокулярные микроскопы (тринокуляры) (рис. Механическая часть микроскопа состоит из предметного столика и штатива, укрепленного на подковообразном основании. Верхняя часть штатива переходит в тубусодержатель, на котором находится вращающийся вокруг своей оси револьвер с ввинченными в него объективами и тубус с окуляром. Тубус одержат ель можно передвигать вверх и вниз с помощью макрометрического винта, вращая его почасовой стрелке (тубусодержатель идет вниз) или против (тубусодержатель идет вверх. Передвигаться по вертикали тубусодержатель может на 50 мм. Для более точной фокусировки объекта кроме макровинта впереди от него имеется микровинт, на барабане 20 которого нанесено 50 делений. Полный оборот микровинта перемещает ту- бусодержатель лишь на 0,1 мм, те. цена деления микровинта всего 2 мкм. Поэтому при наведении резкости на препарат пользуются макровин- тома микровинт поворачивают осторожно только на несколько делений, чтобы исследовать глубину препарата. Мик- ровинт является одной из хрупких частей микроскопа и требует бережного обращения. Предметный столик, на который кладут изучаемый препарат, снабжен двумя клеммами для зажима препарата. Столик может быть круглыми прямоугольным. Круглый столик снабжен подвижной системой, он передвигается при помощи боковых винтов в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Исследуемый препарат передвигается вместе со столиком, что очень облегчает микроскопирование. На квадратном или прямоугольном столике укреплен специальный препаратоводитель, с помощью винтов которого можно передвигать исследуемый препарат по горизонтали и вертикали. Такое перемещение дает возможность перевести любую точку препарата в поле зрения. В современных микроскопах предметное стекло на поверхности столика крепится между держателем и прижимом препаратоводителя, для чего прижим отводится в сторону. Предметный столик в современных микроскопах перемещается по высоте. Грубая фокусировка при исследовании объекта производится макровинтами, расположенными по обеим сторонам тубусо- держателя (штатива. Тонкая фокусировка исследуемого объекта осуществляется вращением микровинтов, также расположенных по обеим сторонам штатива на одной оси с рукоятками грубой фокусировки. Оптическая часть микроскопа включает осветительный аппарат, зеркало, конденсор и собственно оптическую часть – объектив и окуляр. Осветительный аппарат может быть, как в микроскопах нашей лаборатории, вмонтирован в основание микроскопа, и тогда лучи света от него поступают непосредственно в конденсора зеркало отсутствует. Если осветительный аппарат расположен отдельно, то лучи света направляют в конденсор с помощью плоского зеркала (с вогнутым зеркалом работают, когда конденсора нет. В основание микроскопа может быть вмонтирован осветитель ОИ-32 с лампой накаливания мощностью 15 Вт, напряжением 220 В. Яркость регулируют, перемещая патрон с лампой, а при необходимости применяют и светофильтр, гнездо для которого находится под конденсором микроскопа. Включение осветительного аппарата осуществляется выключателем, расположенным в основании микроскопа. Конденсор (от греч. condenso – собираю) состоит из системы линз, которые собирают поступающие на него параллельные лучи водной точке – Рис. 10. Тринокуляр 21 фокусе, при этом лучи собираются в виде конуса, обращенного вершиной к предметному стеклу. Для наилучшего освещения объекта, а это одно из главных условий хорошего микроскопирования, необходимо совместить фокус конденсора с плоскостью исследуемого препарата, что достигают вертикальным передвижением конденсора в пределах 20 мм с помощью винта, расположенного сбоку. Каждый раз, меняя предметное стекло с препаратом, необходимо вновь отрегулировать положение конденсора, так как толщина предметных стекол различна (1,0-1,4 мм, и расположение плоскости препарата при смене стекла будет другим. Количество проходящего через конденсор света (интенсивность освещения) можно регулировать апертурой конденсора, те. открывая или закрывая ирисовую диафрагму, расположенную в нижней части конденсора. Ирисовой она называется потому, что сужается и расширяется наподобие зрачка. Необходимо, чтобы апертура конденсора соответствовала апертуре объектива. Если освещается объект, исследуемый в суховоздушных объективах, имеющих небольшую апертуру (А, например, А = 0,20-0,65, по сравнению с апертурой конденсора А = 0,95-1,00 , ирисовая должна быть несколько прикрыта, чтобы устранять лишний рассеянный свет, идущий от конденсора к объективу. При работе с иммерсионными объективами, имеющими апертуру А = 1,25, те. близкую к апертуре конденсора, ирисовую диафрагму открывают полностью. При этом все лучи, проходящие через конденсор, могут войти ив объектив. Регулировка диафрагмы конденсора и его положение поднятое или опущенное) зависят от исследуемого объекта (рис. При освещении окрашенных препаратов, частично поглощающих свет, необходимо максимальное открытие диафрагмы конденсора и его поднятое положение. Исследование неокрашенных микроорганизмов проводится при суженой диафрагме и опущенном конденсоре, те. получается слабый пучок света. Контрастность неокрашенных микроорганизмов при этом увеличивается, они становятся лучше видны. На рис показано, что при увеличении объективах диафрагма конденсора открыта полностью, а конденсор находится в крайнем верхнем положении (поднят. При увеличении объективах диафрагма конденсора прикрыта, ион слегка опущен. При увеличении объективах диафрагма конденсора закрыта, и конденсор опущен вниз. Изображение диафрагмы конденсора можно наблюдать, если вынуть окуляр из тубуса и смотреть в тубус на последнюю линзу объектива. Величина открытия диафрагмы должна быть такой, которая обеспечивает наиболее контрастное изображение объекта. При слишком открытой диафрагме контрастность изображения снижается. 22 Рис. 11. Соотношение между увеличением объектива, рабочим расстоянием объектива и степенью раскрытия ирисовой диафрагмы конденсора К корпусу конденсора светлого поля снизу крепится откидная оправа для сменных светофильтров. Они предназначены для регулировки яркости изображения объекта. Для достижения наилучшего качества изображения рекомендуется прикрывать диафрагму конденсора светлого поля приблизительно на 1/3 диаметра выходного зрачка объектива. Нельзя регулировать яркость изображения объекта величиной раскрытия диафрагмы или положением конденсора, т. к. при этом снижается разрешающая способность микроскопа. Окуляр состоит из двух линз собирающей, обращенной к объективу, и глазной, обращенной к глазу. Между ними вмонтирована диафрагма, которая пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие наиболее контрастное изображение. Увеличение окуляра (К) указано на его оправе (х, х, х, х. Его вычисляют по формуле К, F – фокусное расстояние линз окуляра L – расстояние наилучшего зрения (25 см) для преломляющей системы глаза. Объектив наиболее важная часть микроскопа. Он состоит из системы взаимоцентрированных линз, заключенных в металлическую оправу. Самая передняя линза называется фронтальной и дает увеличение. Остальные линзы называются корректирующими. Они устраняют недостатки оптического изображения. Достоинство объектива определяется его увеличением и апертурой (охватом линз. Увеличение объектива это соотношение между истинной величиной объектива и его изображением, даваемым линзой. Зависит оно от фокусного расстояния фронтальной (ближней к объективу) линзы. Чем больше кривизна линзы, тем короче ее фокусное расстояние и больше увеличение. Слабые объективы с увеличением х, х имеют фокусное расстояние (F) 50-60 мм, сильные (с увеличением от х дох мм. Увеличение объектива (V) можно определить по формуле V = L/F, где L – оптическая длина тубуса (в среднем 160 мм. Увеличение объектива указано на оправе (х, х, х, х, х. Кроме того, каждый объектив характеризуется определенным рабочим расстоянием (в миллиметрах. У объективов с малым увеличением (х) рабочее расстояние самое большое – 8,91 мм, со средним (х) – меньше – 0,6 мм, ау объективов с сильным увеличением (хи х) – всего 0,12 мм. Соответственно рабочему расстоянию пользуются макрометрическим винтом при работе с объективами хи х или микрометрическим, если объектив х. Апертура объектива (А, охват линзы) – вторая важная характеристика объектива после его увеличения. У слабых объективов Ау средних 0,3-0,65, усильных. Апертура обозначена на оправе объектива. У объективов х, х, х апертура равна соответственно 0,20; 0,65; 1,25. Числовая апертура объектива (А) – это произведение синуса половины самого большого угла (ά), под которым свет входит в объективна показатель преломления света физической средой, находящейся между линзой объектива и предметным стеклом (n), A = n ∙ sin ½ ά (рис. 12). Рис. 12. Схема входа лучей света в объектив (апертура объектива А – объект О – объектив ά - угол вхождения лучей в объектив ½ ά - половина угла вхождения в объектив) Чем больше угол, под которым свет входит в объектив, тем больше его апертура. У объективов, где такой средой является воздух с показателем преломления равным 1, апертура будет выражаться только величиной синуса половины угла лучей, входящих в объектив. Например, если угол вхождения лучей в объектив х – 80º, то синус половины этого угла (40º) равен 0,64; это и есть числовая апертура объективах (А = 0,64 ∙ 1; А = 0,64). Внимание!Нельзя прикасаться пальцами к оптическим деталям микроскопа окуляру, объективу и конденсору. При необходимости их можно протереть сухой мягкой салфеткой. Иммерсионный объектив (х, х, х) по окончании работы обязательно протирается салфеткой, слегка смоченной специальной жидкостью для удаления иммерсионного масла. 24 1.2. Особенности работы с иммерсионными объективами Потому, с какой физической средой граничат объективы, они делятся на суховоздушные и иммерсионные (от греч. immersio – погружаю. Поскольку показатель преломления этой среды (n) влияет на апертуру объектива, он является важным для характеристики объектива. Иммерсионные объективы погружают в различные жидкости, имеющие показатели преломления, близкие к стеклу (для стекла n = 1,515): воду – 1,33, глицерин – 1,4, касторовое масло – 1,49, кедровое – 1,5, гвоздичное, монобромнафталин – 1,6. Название среды, в которую должен погружаться объектив, нанесено на оправу. Например, МИ 90x означает масляная иммерсия, увеличение 90 раз ВИ 40x – водная иммерсия, увеличение 40 рази т.д. При использовании иммерсии во фронтальную линзу объектива проходит наибольшее количество лучей, не отклоняясь, как это происходит с лучами при прохождении их через воздушную среду, имеющую другой показатель преломления по сравнению со стеклом (рис. 13). Рис. 13. Влияние иммерсии на ход лучей света в микроскопе 1 – объектив 2 – лучи, отклоняющиеся при прохождении через воздушную среду 3 – воздух с показателем преломления n=1,0; 5 – лучи, идущие от осветителя иммерсионное масло с показателем n=1,5; 7 – лучине отклоняющиеся при прохождении через масло и прошедшие в объектив 8 – фронтальная линза объектива Апертура иммерсионных объективов больше, чему суховоздушных. Например, при самом максимальном угле вхождения света в объектив (120˚) апертура для суховоздушного объектива будет А = sin ½ ά 120˚∙n, где sin 60˚ = 0,87; n = 1, те. А = 0,87. Для иммерсионного объектива МИ 90x, притом же угле вхождения лучей в объектив (ά =120˚ ) апертура будет A = sin ½ 120˚∙n, где sin 60˚ = 0,87; n = 1,515, те. АРа з решающая способность объектива (d) – важная характеристика, от которой зависит разрешающая способность микроскопа в целом. Разрешающая способность это наименьшее расстояние между двумя точками объекта, когда они рассматриваются отдельно. Разрешающая 25 способность объектива зависит от длины волны света (λ), при котором ведёт- ся исследование, от апертуры объектива и выражается формулой d = λ A 1 + Для светового микроскопа длина волны в среднем 0,55 мм, апертура Ау каждого объектива своя, например, для МИ 90x А = 1,25, А – апертура конденсора, А = 0,95. Расстояние между двумя точками объекта, разрешаемое объективом, при этом будет d = 0,55/2,20 = 0,2 мкм. Чем меньше длина волны используемого света, тем больше разрешающая способность объектива, тем меньшей величины объект можно увидеть. Увеличением икр ос копа (V микр ) – величина, определяемая произведением увеличения объектива (об) на увеличение окуляра (V ок ): об ∙ V ок = V микр 1.3. Понятие об аберрации и способы её устранения Увеличение объекта с помощью линз со сферическими поверхностями имеет два недостатка. Во-первых, точка объекта приобретает вид не точки, а кружка. Этот дефект называется сферической аберрацией. Причина его вне- равномерном преломлении краевых и центральных лучей, в результате чего краевые лучи пересекаются ближе к линзе, чем центральные. Точка при этом распределяется в пространстве между местами пересечения лучей и превращается в кружок. Во-вторых, при увеличении объекта с помощью линз он приобретает окраску, которой на самом деле не имеет. Это хроматическая аберрация, вызванная неравномерным преломлением коротковолновых лучей (сине- фиолетовый спектр) и длинноволновых (оранжево-красный). Специальная конструкция объективов с применением коррекционных линз со строго пропорциональными спектрами дала возможность получить объективы-ахроматы, те. устраняющие окраску. Они содержат, кроме фронтальной, до 6 коррекционных линз. Микроскоп МБИ-1 снабжён такими объективами. Более совершенные объективы устраняют не только хроматическую, но и сферическую аберрацию и называются апохроматами. В них содержится до 10-12 коррекционных линз, изготовленных из специального стекла. На оправе таких объективов есть обозначение «АПОХР». Кроме того, в лучших объективах делается коррекция на ровность поля зрения, те. на одинаковую четкость изображения в любом месте поля зрения. Это особенно важно при фотографировании объекта. Такие объективы носят название планхроматы (от лат. план – полностью) и имеют на оправе обозначение ПЛАН. При использовании объективов «АПОХР» или ПЛАН применяют компенсационный окуляр с обозначением «КОМП». 26 2. Техника микроскопирования готовых препаратов 1. Включить осветитель микроскопа в электросеть. 2. Поместить на предметный столик препарат и зажать его клеммами. 3. Установить правильное освещение объекта с помощью конденсора (см. рис. 4. Рассмотреть препарат при суховоздушном объективе, учитывая, что рабочее расстояние суховоздушных объективов 0,4 – 0,6 мм. 5. Найти наилучшее поле исследования. 6. Подняв тубус микроскопа, установить иммерсионный объектив (МИ, х, нанести на препарат стеклянной палочкой небольшую каплю иммерсионного масла. 7. Под контролем глаза сбоку погрузить объектив в масло до упора его в предметное стекло. 8. Глядя в окуляр, медленно поднимать тубус макровинтом до появления в поле зрения изучаемого объекта. 9. С помощью микровинта произвести установку резкости изображения. 10. После изучения препарата тубус поднять, а объектив тщательно протереть марлевой салфеткой до полного снятия масла. 11. Препарат убрать в сосуд с дезраствором, а микроскоп закрыть чехлом. Вопросы для самостоятельной работы Оптические детали микроскопа. Типы объективов и их характеристика. Разрешающая способность объектива. Увеличение микроскопа. Понятие об аберрации и способах её устранения. Техника микроскопирования с применением иммерсионного объектива. Механическая часть микроскопа. Библиографический список Основной 1. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии М Агропромиздат, 1988. 2. Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – М Высш. шк, – 1981. С. 5-10. Дополнительный 3..Мудрецова – Висс КА. Микробиология, санитария и гигиена учеб. для вузов КА. Мудрецова – Висс, А.А. Кудряшова и др е изд. – М Изд. дом Деловая лит, 2001. 4. Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М Колос, 1993. 5. Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, В.К. Шильникова. – М Агропро- миздат, 1990. 6. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М Колос, 1993. 27 Тема 2. Морфология микроорганизмов в окрашенном состоянии План 1. Используемые красители. 2. Приготовление мазка-препарата. 3. Простой метод окрашивания. 4. Сложные методы окрашивания - окраска туберкулёзных бактерий по методу Циля-Нильсена; - метод окраски микроорганизмов по Граму; 5. Негативное окрашивание. 1. Используемые красители Самым удобным методом изучения морфологии микроорганизмов является микроскопия окрашенных препаратов, приготовленных из исследуемой культуры бактерий. При этом можно увидеть форму, размеры, взаимное расположение микроорганизмов. Для окраски микроорганизмов чаще всего используются анилиновые красители (С 2 Н 2 –NH 2 – формула анилина. Они бывают основными и кислыми. К кислым красителям относятся те, у которых ион, придающий окраску хромофор, - анион. У основных красителей хромофором является катион. В микробиологии применяются, как правило, основные красители, так как именно они хорошо связываются с кислыми компонентами бактериальных клеток и дают прочное окрашивание. К основным красителям относятся фуксин основной, нейтральный красный, сафранин, дающие красное окрашивание генцианвиолет, метиленовая синь, кристаллвиолет – фиолетовое малахитовая зелень – зеленое, хризоидин – коричневое. К кислым красителям относятся кислый фуксин, эозин, эритрозин красные краски, конго и пикриновая кислота (желтые) и нигрозин (черный. Анилиновые красители поступают в виде сухих порошков, из которых в лаборатории готовят насыщенные спиртовые растворы, сохраняющиеся впрок. Сами спиртовые растворы непригодны для окраски бактерий, из них приготовляют разведенные водные растворы. В том случае, когда нужно более глубокое проникновение краски в микробную клетку, к водно-спиртовому раствору красителя добавляют щелочь, карболовую кислоту или другие аналогично действующие вещества. Существуют простые и сложные (дифференциальные) методы окрашивания микроорганизмов. При простом методе используется один краситель, при сложном – несколько. Какой бы метод окрашивания не избрал исследователь, он должен сначала правильно приготовить препарат. 28 2. Приготовление мазка-препарата Для приготовления мазка пользуются хорошо вымытыми и обезжиренными предметными стеклами (для обезжиривания их предварительно помещают в смесь равных объемов спирта и эфира. Можно обезжирить стекло, протерев его с обеих сторон кусочком хозяйственного мыла. Приготовление мазка складывается из нескольких этапов приготовление, высушивание, фиксация и окраска. 1. В центре стекла специальным восковым карандашом делают метку- овал размером около 2 см 2. На противоположную отметки сторону стекла наносят обожженной в пламени спиртовки петлей каплю физиологического раствора. 3. Вносят в каплю обожженной петлей культуру микроорганизмов, выросших на твердой питательной среде. Если культура микроорганизмов выращена на жидкой питательной среде, наносят на стекло сразу каплю этой культуры без физиологического раствора. 4. Петлей равномерно распределяют каплю с исследуемым материалом, содержащим микроорганизмы, по стеклу в пределах метки, затем петлю обжигают. Обожженную петлю ставят в стакан. 6. Подготовленный мазок высушивают на воздухе. 7. Сухой мазок фиксируют, проводя стекло над пламенем 3-4 раза мазком вверх, как бы придавливая пламя. Надежность фиксации проверяют, приложив стекло к тыльной стороне ладони – стекло должно быть тёплым. В случае перегрева мазок испортится, так как произойдет свертывание белка, нарушится морфология бактерий, и мазок придется готовить заново. Фиксация осуществляется для того, чтобы закрепить микробы на стекле, улучшить восприимчивость к окрашиванию и убить их, те. сделать препарат безопасным для дальнейшей работы. Фиксированный препарат готов к окрашиванию различными методами. Приготовление мазка-отпечатка Мазок-отпечаток, изготовляемый 2- 3 прикосновениями чистого предметного стекла к свежему срезу объекта, например, пищевых продуктов плотной консистенции (мясо, рыба, колбаса, ветчина, к колониям грибов, актиномицетов, иногда эубактерий. Препарат высушивают, фиксируют жидким фиксатором, окрашивают, микроскопируют. Прикосновение должно быть строго вертикальным продолжительностью 1 -2 с. Простой метод окрашивания Этот метод позволяет быстро и хорошо ознакомиться с общей морфологией клетки, ввиду чего он применяется очень часто. При простом методе используют один какой-нибудь краситель, окрашивающий все бактерии в 29 один цвет – чаще всего фуксин Пфейффера, который красит быстро и интенсивно (окраска длится 2 мин, или метиленовую синь. Ею красят 3-5 мин, так как синька проникает в клетки медленнее, бактерия красятся не так ярко, как фуксином, зато препарат получается более изящным. Рис. 14. Основные формы и расположение микроорганизмов. Шаровидные формы 1 – гонококки 2 – энтерококки; 3 – пневмококки 4 – капсула пневмококков 5 – стрептококки 6 - стафилококки 7 – мо- нококки; 8 – сарцины. Палочковидные формы 9 – неспорообразующие палочки (бактерии 10 – коринебактерии дифтерии 11 – спорообразующие палочки бациллы- спорообразующие палочки (клостридии. Извитые формы 13 – вибрионы 14 – спириллы 15– лептоспиры 16– боррелии; 17 – трепонемы Правильно приготовленный и зафиксированный препарат помещают на стеклянный мостик над ванночкой мазком вверх. Наносят навесь мазок любую анилиновую краску (по выбору) и оставляют ее на препарате определенное время. Затем краску смывают с препарата легкой струёй воды и осторожно промокают между листами фильтровальной бумагой. Высушенный мазок микроскопируют с применением иммерсии (объектив МИ х. При исследовании мазка можно увидеть форму и размеры микроорганизмов, их взаимное расположение. Различные формы микроорганизмов представлены на рис. 14. 30 Сложные методы окрашивания Эти методы подразумевают использование нескольких красителей для окрашивания одного и тогоже препарата. Красители применяются для отличия (дифференциации) одних видов бактерий от других. Существует многоразличных сложных методов окрашивания микроорганизмов, позволяющих выявить споры, капсулы, жгутики. Одним из методов является следующий. Окраска туберкулезных бактерий по методу Циля-Нильсена Сущность метода окраски по Циль-Нильсену Метод основам на использовании того факта, что у туберкулезных бактерий) в клеточной стенке находится много жи- роподобных и восковых веществ, поэтому бактерии устойчивы не только к обычным красителям, но и к действию кислот, щелочей и спиртов. Это свойство учитывается при окраске. Обычные бактерии, которые также присутствуют в патологическом материале наряду с туберкулёзными, относятся, как правило, к сапрофитным, некислотоустойчивым. Препарат обрабатывают кислотой. Она вымывает краску из сапрофитных некислотоустойчивых бактерий, нона кислотоустойчивые, те. на туберкулезные, не действует. Препарат дополнительно красят метиленовой синью. Остаются окрашенными фуксином Циля в рубиново-красный цвет туберкулезные бактерии, а сапрофитные, обесцвеченные кислотой, воспринимают окраску метиленовой синью и окрашиваются ею в синий цвет. Техника окрашивания методом Циля-Нильсена: 1. Подготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, обрабатывают 5 м раствором хромовой кислоты в течение 5-10 мини промывают водой. 2. Окрашивают карболовым фуксином Циля при одновременном осторожном нагревании в течение 2-3 мин. Для этого предметное стекло с одного конца берут пинцетом и нагревают над пламенем горелки до появления паров (ноне до кипения. По мере испарения красителя необходимо доливать его по каплям, не допуская подсыхания. Промывают препарат водой. Микробные клетки остаются окрашенными в красный цвет. 3. Обесцвечивают препарат 1 м раствором серной кислоты в течение 10-15 с, промывают водой (споры остаются окрашенными в красный цвета микробные клетки обесцвечиваются. 4. Дополнительно окрашивают препарат метиленовым синим около 20 мин. Промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. При правильном окрашивании микробные клетки должны быть синими, споры красными, фон – бесцветный. Сложный метод окраски по Цилю-Нильсену применяют конкретно в тех случаях, когда надо выявить в материале туберкулезные бактерии, те. это пример сложного метода окраски, имеющего ограниченное применение 31 Окраска микроорганизмов по методу Грама Сложный метод окраски, который применяется очень широко, при исследовании абсолютно всех видов бактерий в целях их систематики. Сущность окраски по Граму заключается в том, что некоторые краски (генцианвиолет) присоединении с йодом и компонентами клеточной стенки ряда бактерий образуют прочный комплекс, который окрашивает бактерии, имеющие 90% муреина, в фиолетовый цвет. Комплекс не вымывается спиртом. Эти бактерии называются Гр. К ним относятся кокки, бациллы, акти- номицеты. У Гр) бактерий, имеющих лишь 10% муреина, такого прочного комплекса не образуется, генцианвиолет легко вымывается из клеток спиртом, они становятся бесцветными. Такие бактерии необходимо докрашивать дополнительно другой краской, как правило, фуксином в красный цвет. К Гр) относятся микроорганизмы группы кишечной палочки, а также патогенные бактерии – сальмонеллы, шигеллы, спирохеты. Еще в 1884 г. датский ученый Х. Грам (Ch.Gram) предложил использовать метод окраски микроорганизмов, который не потерял своего значения и сейчас. Метод используется для систематики микроорганизмов, т.к. в зависимости от окраски по Граму микроорганизмы делятся на грамположительные Гр) и грамотрицательные Гр, и относятся они при этом к разным систематическим группам. Разница в восприятии окраски связана с разным строением и биохимическим составом клеточной стенки у разных бактерий. Опорным каркасом клеточной стенки у бактерий служит муреин (гетерополимер). У Гр) бактерий муреина немного, около 10% сухой массы клеточной стенки. Муреин располагается в один слой, между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной имеется периплазматическое пространство. Сверху муреина, как бы приклеенные к нему снаружи, в большом количестве находятся липопротеиды, липосахариды, фосфолипиды. Последние являются поверхностными антигенами Гр) бактерий. У Гр) бактерий содержание муреина в клеточной стенке достигает 90%, при этом муреин располагается в виде множества слоев. Снаружи му- реина находятся тейхоевые кислоты (полимеры рибитфосфорной и глице- ринфосфорной кислот, которые и будут поверхностными антигенами этих бактерий. Техника окрашивания по Граму: Фиксированный мазок заливают красителем генцианвиолет. Выдерживают мин. Стряхивают краску в лоток и на препарат наливают раствор Люголя на 2 мин. Остатки краски стряхивают со стекла. Обрабатывают препарат м спиртом, нанося его на препарат нас. Время обесцвечивания мазка нужно соблюдать особенно тщательно. Препарат промывают водой. 32 Окрашивают фуксином Пфейфера 5 мин. Фуксин Пфейфера сливают, мазок промывают водой. Осторожно высушивают мазок между листами фильтровальной бумаги. Препарат микроскопируют с применением иммерсионного объектива МИ х. Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвета грамотрицательные – в красный. Негативное окрашивание Сущность метода. При этом способе окрашивания краска распределяется между микроорганизмами на препарате, создавая окрашенный фона сами микроорганизмы при этом не красятся, но они становятся более контрастными, контуры их обрисовываются более четко. Сами бактерии остаются неубитыми, следовательно, форма их и размеры соответствуют действительным. Метод негативного окрашивания используют при изучении микрофлоры зубного налета, который дает возможность рассмотреть нормального обитателя полости рта – спирохету. Техника окраски по Бури Исследуемый материал и тушь наносят по капле на предметное стекло и быстроих смешивают, распределяя на стекле, а затем дают высохнуть. Высохший мазок микроскопируют с иммерсией (МИ х. На черном фоне видны неокрашенные капсулы и клетки бактерий. Техника окраски конго красным На предметном стекле смешивают каплю исследуемого материала с каплей го водного раствора конго красного. Смесь распределяют по стеклу круговыми движениями от центра к краям. Высушенный мазок исследуют с иммерсией (МИ х. На красном фоне видны неокрашенные капсулы и микроорганизмы различной формы (извитые, палочковидные, кокки. 33 Тема 3. Морфология микроорганизмов в живом неокрашенном состоянии и методы её изучения План Приготовление препарата раздавленная капля. Приготовление препарата висячая капля. Метод изучения микроорганизмов в живом состоянии имеет, то преимущество, что микробы изучаются в неповрежденном состоянии. Можно наблюдатьих подвижность и по характеристике подвижности определить наличие и расположение жгутиков (рис. б а в г Наблюдать за живыми микроорганизмами можно в любых жидкостях настоях сена, отварах овощей, фруктов) ив чистых молодых культурах бактерий, выращенныхна жидких питательных средах. 1. Приготовление препарата раздавленная капля Для наблюдения за подвижностью микроорганизмов пользуются препаратами, приготовленными из живых организмов. Объектом исследования могут служить любые жидкости (настой сена, овощей, фруктов, кусочков мяса, рыбы, навоза и т.д.), а также чистые культуры микроорганизмов. На предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости. Рядом с ней на ребро ставят покровное стекло и постепенно опускают его на каплю. При осторожном опускании капля раздавливается, а между стеклами не остается пузырьков воздуха, мешающих микроскопированию. Препарат исследуют суховоздушными объективами (х, х) приопущенном конденсоре и суженной диафрагме. При этом видны микроорганизмы, которые, оставаясь живыми, продолжают двигаться в поле зрения микроскопа, если они обладают жгутиками. Активно движущиеся бактерии проплывают через все поле зрения, другие совершают вращательные или круговые движения. Если у бактерий нет жгутиков, они совершают беспорядочное колебательное броуновское движение. Рис. Типы жгутикования бактерий а – лофотрих; б – монотрих; в – амфитрих; г - перитрих 34 2. Приготовление препарата висячая капля В препарате рассматривают суспензии живых микроорганизмов, при этом взвесь не должна быть очень густой. Для приготовления препарата используются предметные стекла с луночкой. Края луночки снаружи предварительно смазывают вазелином. На середину покровного стекла наносят петлей каплю исследуемой жидкости. Предметное стекло переворачивают лункой вниз и опускают на покровное стекло так, чтобы находящаяся нанем капля приходилась в центр лунки. Предметное стекло слегка прижимают к покровному стеклу, истекла склеиваются. Препарат приподнимают и быстро переворачивают покровным стеклом кверху. Получилась герметическая камера, в которой капля свободно свисает с покровного стекла, в луночку,не соприкасаясь с ее краями. Рассматривают препарат под малым увеличением микроскопа при суженной диафрагме и опущенном конденсоре. В зависимости от расположения жгутиков у бактерий различают монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков на одномизконцов, амфитрихи – пучки жгутиков с двух полюсов клетки, перитрихи – жгутики по всей поверхности клетки. Вопросы для самостоятельной работы Техника приготовления мазка-препарата. 2. Значение фиксации препарата. 3. Простые методы окрашивания. 4. Сложные методы окрашивания. Что дают они исследователю 5. Техника окрашивания препарата по Граму. 6. Исследование микроорганизмов в живом состоянии (методы. 7. Другие современные методы изучения морфологии бактерий. Библиографический список Основной 1. Асонов Н.Р. Микробиология. – е изд, перераб. и доп. – М Колосс. 2. Асонов Н.Р. Практикум по микробиологии М Агропромиздат, 1988. 3. Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. – М Высш. шк, 1981. С. 5-10. Дополнительный 4. Мудрецова – Висс КА Микробиология, санитария и гигиена учеб. для вузов КА. Мудрецова – Висс, А.А. Кудряшова и др е изд. – М Изд. дом Деловая лит, 2001. 5. Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М Колос, 1993. 6. Емцев Е.Т. Микробиология / Е.Т. Емцев, В.К. Шильникова. – М Агропро- миздат, 1990. 35 7. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. – М Колос, 1993. 36 3. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И МЕТОДЫ ЕЁ ИЗУЧЕНИЯ  перейти в каталог файлов | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |