1. Классификация микроорганизмов. Микробы, или микроорганизмы
 Скачать 100.5 Kb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
 С этим файлом связано 26 файл(ов). Среди них: Razdel-_Serdechno-sosudistaya-sistema_2_1.doc, Testy_po_anatomii.doc, VND.docx, ekz_testy_1360.docx, norfiz_VND.docx и ещё 16 файл(а). Показать все связанные файлы21. Основные методы микробиологической диагностики. Микроскопический. С помощью микроскопии нативного патологического материала определяют вид возбудителя заболевания по форме, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными кра сителями. Бактериологический. Этот метод основан на выделении чистой культуры возбудителя заболевания и его идентификации (определение вида микроба). Биологический. В основе этого метода лежит заражение лабораторных животных исследуемым материалом от больного с целью воспроизведения у них инфекционного заболевания или последующего выделения возбудителя. Аллергический. С помощью этого метода обнаруживают повышен ную чувствительность макроорганизма к определенным возбудителям инфекционных заболеваний или продуктам их жизнедеятельности. Для аллергических проб используют препараты, которые называются аллергенами. Молекулярно-генетический. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяют в исследуемом материале наличие возбудителя инфекционного заболевания по специфичным для него последовательностям нуклеотидов. 22. Приготовление МПБ и МПА. Приготовление мясо — пептонного бульона (МПБ) Первый этап- получение мясной воды. Мясо, очищенное от жира и от су хожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством холод ной водопроводной воды и настаивают в течение суток в прохладном месте. За тем мясной настой вместе с мясом кипятят в течение 1 часа, после чего осту жают, фильтруют, доливают водопроводной водой до первоначального объема, разливают по бутылям и стерилизуют при давлении 1атм. 30 минут. Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Второй этап- к мясной воде прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлори да натрия, кипятят, устанавливают рH 20 % раствором едкого натра. Приготовление мясо — пептонного агара (МПА) К мясо — пептоному бульону добавляют 2% морской водоросли агар-агара, который плавится при 100°С и затвердевает при комнатной температуре. После стерилизации в автоклаве мясо — пептонный агар, разлитый в пробирки, остав ляют застыть столбиком или готовят скошенный агар, укладывая пробирки в наклонном положении под углом 20°С. 23. Требования к питательным средам. 1. Питательные среды должны содержать все необходимые для питания микроба питательные вещества, т.е. обладать питательностью. 2. Иметь достаточную влажность 3. Иметь оптимальную рН (7,2-7,6) кислотность среды. 4. Обладать изотоничностью (концентрация NaCl 0,87%), для галофильных бактерий концентрация соли 1% и выше. 5. Иметь оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов. 6. Быть прозрачными, чтобы был виден рост бактерий, особенно в жидких средах. 7. Быть стерильными (чтобы не было других бактерий). 24. Правила посева на плотные и жидкие питательные среды. Посев в чашку Петри шпателем Левой рукой приоткрывают крышку. Материал набирают петлей или в пи петку, наносят на поверхность МПА и втирают шпателем по всей поверхности агара. При посеве материала, обильно обсемененного микрофлорой, использу ют 2-3 чашки для последовательного посева. Посев в пробирку петлей Полученные изолированные колонии служат для выделения чистой куль туры микроба. Осторожно приподняв крышку чашки, захватывают прокаленной и осту женной петлей одну отдельно расположенную колонию и вносят в пробирку с плотной питательной средой. Пробирку держат в наклонном положении в ле вой руке между большим и указательным пальцами. Правой рукой держат пет лю с посевным материалом. Мизинцем, мякотью ладонью правой руки выни мают пробку из пробирки, обжигают в пламени горелки ее край и вносят в нее петлю, посев производят: а) штрихами на поверхности агара; б) уколом в столбик агара. При посевах и пересевах внимание работающего должно быть обращено на соблюдение правил стерильности: чтобы с одной стороны не загрязнить свои посевы посторонней микрофлорой, а с другой — не явиться источником инфек ции для окружающих. Посев из пробирки в пробирку Обе пробирки держат в левой руке слегка наклонно, причем пробирку с посевным материалом держат ближе к себе. В правой руке, как писчее перо держат бактериальную петлю и прокаливают ее вертикально в пламени горел ки. Мизинцем и краем ладони правой руки вынимают одновременно пробки из обеих пробирок- края пробирок обжигают в пламени горелки. Прокаленной петлей набирают немного посевного материала и вносят в пробирку с жидкой средой. Необходимо следить за тем, чтобы среда не вылилась и не касалась пробки. После посева петлю извлекают из пробирки, края пробирки обжигают и, проведя пробку через пламя горелки, закрывают пробирку, после чего прока лывают петлю. Посев жидкого материала можно производить стерильными пастеровскими или градуированными пипетками. Пробирки с засеянной куль турой этикируют и помешают в термостат. 25. Идентификация бактерий по ферментативной активности Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды. Для определения протеолитической активности микроорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Через 3—5 дней посевы просматривают и отмечают характер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их определения служат специальные индикаторные бумажки, которые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разложения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку. Для многих микроорганизмов таксономическим признаком с-лужит способность разлагать определенные углеводы с образованием кислот и газообразных продуктов. Для выявления этого используют среды Гисса, содержащие различные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу и др.). Для обнаружения кислот в среду добавлен реактив Андреде, который изменяет свой цвет от бледно-желтого до красного в интервале рН 7,2—6,5, поэтому набор сред Гисса с ростом микроорганизмов называют «пестрым рядом». Для обнаружения газообразования в жидкие среды опускают поплавки или используют полужидкие среды с 0,5% агара. Для того чтобы определить интенсивное кислотообразование, характерное для брожения смешанного типа, в среду с 1% глюкозы и 0,5% пептона (среда Кларка) добавляют индикатор метиловый красный, который имеет желтый цвет при рН 4,5 и выше, и красный — при более низких значениях рН. Гидролиз мочевины определяют по выделению аммиака (лакмусовая бумажка) и подщелачиванию среды. При идентификации многих микроорганизмов используют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — промежуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свидетельствует о наличии бутандиолового брожения. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1 % раствором перекиси водорода. Для определения цитохромоксидазы применяют реактивы: 1) 1% спиртовый раствор сс-нафтола-1; 2) 1% водный раствор N-диметил-р-фенилендиамина дигидрохлорида. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появляющемуся через 2—5 мин. Для определения нитритов используют реактив Грисса: появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов. 26. Заражение куриного эмбриона. Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения; на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и ам-ниотическую полость, в желточный мешок. Перед-заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0.05 — 0.2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой. Вскрытие эмбрионов производят через 48 — 72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хролантоиской оболочке определяют: 1. По белесоватым непрозрачным пятнам разной формы; 2. В реакции гемаглютинации. 27. Метод индикации вирусов. I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопаттескому действию(ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим из менениям клеток. а) Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. б)Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплош ного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточ ные островки. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация кле ток. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Не которые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4^-6-й день). Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. оп ределения их видовой принадлежности. Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям,которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препара тах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных флюорохромами. В послед нем случае используют люминесцентную микроскопию. Для исследования морфологии контаминированных клеток используют специальный инвертированный микроскоп, у ко торого осветитель располагается сверху, а объективы — снизу от предметного столика. С помощью такого прибора можно оценивать морфологию клеток, растущих в виде монослоя на поверхности контейнера для культивирования. Морфологичес кие изменения клеток выявляют при микроскопическом ис следовании культуры с помощью объектива 8х или 40х. При сравнении клеточного монослоя, инфицированного вирусом, с незараженными клетками в контрольной пробе отмечают полное или островковое разрушение пласта клеток либо другие изменения, которые характеризуют ЦПД вируса. Для более детального изучения ЦПД в контейнер для культивирования помещают покровное стекло, на котором образуется монослой. В дальнейшем стекло извлекают, зараженные клетки фиксиру ют и готовят микроскопический препарат, который окрашива ют флюорохромами и т.д.) и изучают иммерсионным методом. ЦПД вирусов можно также продемонстрировать с помощью"цветной пробы": метаболически активные клетки культуры в ходе жизнедеятельности выделяют кислые продукты, что вы зывает изменение цвета индикатора, присутствующего в культуральной среде. При репродукции вируса клетки утрачивают способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется. II. Реакцию гемагглютинации(РГА) применяют для обна ружения гемагглютинирующих вирусов в культуральной жид кости зараженной культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. Гемагглютинацию — "склеивание" эритроцитов разных видов животных(кур, гусей, морских свинок) — вызывают вирусы, содержащие воболочке гемагглютинин.Для постановки реакции гемагглюти нации к исследуемому материалу добавляют взвесь эритроцитов. В присутствии вирусов происходит агглютинация эритроцитов. Более точным количествен ным методом учета отдель ных вирусных частиц являет ся метод бляшек. Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тон ким слоем агара. После ин кубирования посевов в тече ние нескольких суток на по верхности агара появляются просветленные участки опре деленной формы (бляшки), представляющие собой участ ки погибших клеток в сплош ном монослое культуры клеток. Каждая бляшка образуется при размножении одной ви русной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим ме тодом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появления бляшек разли чаются не только у разных видов вирусов, но и у отдельных штаммов одного и того же вида. Перечисленные признаки используют для селекции штаммов и получения так называе мых чистых линий вирусов. 28. Морфологические и структурные особенности фагов, химический состав Большинство фагов под электронным микроскопом имеют форму головастика или сперматозоида, некоторые—кубическую и нитевидную форму. Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов. Наиболее хорошо изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида. Они состоят из вытянутой икосаэндрической головки размером 65-100 нм и хвостового отростка длиной более 100 нм. Внутри хвостового отростка имеется полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, снаружи –чехол, способный к сокращению наподобие мышцы. Хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят нитевидные структуры –фибриллы. Различают несколько морфологических типов фагов: к I типу относятся нитевидные ДНК-содержащие фаги, которые лизируют «мужские» клетки, несущие F-плазмиды; II группу составляют фаги с аналогом отростка, это мелкие РНК –содержащие фаги и фаги с одной спиралью ДНК; в III тип включены фаги без отростка; в IV тип –фаги с коротким отростком и двунитчатой ДНК (они отличаются строением отростков); к V типу относятся ДНК –содержащие фаги с несокращающимся «чехлом» отростка и головкой разной формы и величины: VI тип –это фаги с сокращающимся «чехлом» отростка и сложной структурой, содержат двунитчатую ДНК. Химический состав. Фаги состоят из двух основный химических компонентов - нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белка. У фагов, имеющих форму сперматозоида, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спиралей внутри головки. Белки входят в состав оболочки (капсида), окружающей нуклеиновую кислоту и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и представлены в виде множества идентичных субъединиц, уложенных по спиральному (в отростке) или кубическому (в головке) типу симметрии. Кроме структурных белков, у некоторых фагов обнаружены внутренние (геномные) белки, связанные с нуклеиновой кислотой, и белки –ферменты (лизоцим АТФаза), участвующие во взаимодействии фага с клеткой. 29. Фазы взаимодействия фага с бактериальной клеткой Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл.
Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь). Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели:
Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200—1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии. 30. .Применение фагов Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют метод фаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис .Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды (например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных болезней. Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты. перейти в каталог файлов | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |