физиол сх и декор пособие. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования башкирский государственный университет
 Скачать 1.41 Mb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
4.2.2. Методы диагностики вирусных болезней Визуальная диагностика. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена в связи с бессимптомным (латентным) характером развития болезней. Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена. Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся желтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть мозаичными, крапчатыми или совсем желтыми (хлоротичными). Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения хозяина и условий среды, но, в любом случае, он составляет несколько дней или недель. Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если зараженные растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражен посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причем появление зараженных участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву. Хотелось бы отметить также, что существуют симптомы, напоминающие поражения вирусами, но вызванные другими причинами. Сходные симптомы поражения имеют фитоплазмы и некоторые бактерии. Точечные некрозы, вызванные поражениями растений тлями и клещами, также нередко путают с вирозами, например, большая картофельная тля вызывает скручивание, деформацию и местный хлороз листьев огурца. К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят обычные нарушения минерального питания (например, связанные с дефицитом железа). Различные деформации органов могут вызывать гербициды гормональной природы. Таким образом, точная идентификация по внешним признакам поражения вирусами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, PCR-анализ и т.д.). Метод индикаторных растений является широко распространенным методом диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных), дающих четкие, часто строго специфичные по отношению к определенному виду вируса, симптомы. Заражение травянистых растений-индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Заражение проявляется в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменением окраски, угнетением роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (Nicotianaglutinosa), для диагностики Х-вируса картофеля – амарант шаровидный (Gomphrenaglobosa). В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растений-индикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки, так для диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Fragariavesca). Редко для передачи вирусов используют насекомых–переносчиков и растение-паразит повилику. Серологическая диагностика. Если теплокровному животному ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфические к нему антитела, связывающие антиген. В результате реакции образуется осадок (преципитат, или серум), различимый визуально или с помощью микроскопа. Практическое значение для идентификации вирусов в растении имеют следующие модификации: 1. Капельный метод, при котором на предметном стекле каплю антисыворотки смешивают с каплей сока растения, и через несколько минут оценивают реакцию под микроскопом при малом увеличении в тёмном поле или даже визуально без микроскопа. 2. Для определения сферических и других мелких вирусов используют метод двойной диффузии в агаровом геле. При этом в одни лунки, вырезанные в слое агаровой среды, добавляют антисыворотку, а в другие очищенный сок растения. Антитела и вирусные частицы диффундируют в геле навстречу друг другу и образуют в месте встречи отчетливые линии преципитации. 3. При использовании метода радиальной иммунодиффузии антисыворотку добавляют непосредственно в агаровую среду, а лунки заполняют соком, в случае положительной реакции вокруг лунок образуются преципитаты в форме колец. 4. Метод адсорбции основан на том, что перед реакцией с антигеном антитела связывают каким-либо инертным материалом с крупными частицами, например, латексом. При реакции с антигеном происходит хорошо заметная агглютинация всего комплекса. 5. Наиболее высокочувствительной, позволяющей получать количественные оценки модификацией является иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на связывании антител определёнными метками — ферментами. В лунки микроплаты из полимерных материалов добавляют антисыворотку и очищенный сок, содержащий антитела, между ними происходит первая иммунная реакция. Затем на фиксированный комплекс антиген-антитело наносят раствор антител, связанных ферментом (фосфатаза или пероксидаза), при этом меченные ферментом антитела наслаиваются на детерминанты молекул антигена, и происходит вторая иммунная реакция. После добавления соответствующего ферментного субстрата происходит ферментная реакция по каталитическому расщеплению субстрата, что обнаруживается с помощью фотометра по цветной реакции. Метод электронной микроскопии. С помощью электронных микроскопов в ультратонких срезах поражённых частей растений можно установить форму, строение и даже размеры вирусов. Трансмиссионный электронный микроскоп используют для серийных анализов вирусной инфекции в соке иммуноэлекгронной микроскопией, при которой можно обнаруживать вирусные частицы с наслоившимися антителами. Метод гель-электрофореза. Этот метод основан на электрофоретическом разделении предварительно очищенных нуклеиновых кислот вируса (вироида) или его белкового компонента в геле при силе тока 3 и 6 мА с окрашиванием зон соответственно нуклеиновых кислот или белков. При сравнении полученных окрашенных линий с высотой стандартных маркерных зон определяют массу (соответственно и размеры) вирусных структур. Метод ДНК-зондов основан на принципе комплементарности нуклеиновых кислот. Синтезируют зонды, которые узнают определённые нуклеотидные последовательности РНК вируса. В зависимости от выбора зондов можно дифференцировать группы, виды и даже штаммы вирусов. Молекулярно-биологический метод основан на знании строения молекулы РНК вируса. Наиболее распространённым тестом является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей РНК в ходе полимеразной цепной реакции (PCR). При этом отдельные фрагменты РНК, специфичные только для одного вида или группы родственных вирусов, многократно с помощью ферментов размножают, при этом их количество превышает исходное число копий выбранного фрагмента РНК в миллионы раз. Далее их обнаруживают методом электрофореза в геле или методом иммунофлуоресценции. Частные методы исследований. Метод включений. Развитие некоторых вирусов в клетках растения сопровождается образованием в ней скопления вирусных частиц (включений, кристаллов Ивановского), которые обнаруживаются с помощью обычного светового микро скопа. Каждому виду вируса свойственна своя форма вирусных включений, образующихся обычно в клетках волосков или эпидермиса листьев. Например, для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы; для Х-вируса картофеля типично образование сферических аморфных тел. Для выявления зелёной крапчатой мозаики огурца, скручивания листьев картофеля и некоторых других применяют химические аналитические методы диагностики. Методы диагностики бактериальных болезней. 1. Визуальный анализ симптомов. Точно определить заболевание на основе симптомов можно только в редких случаях, когда симптомы носят специфический характер. На бактериальную природу некрозов часто указывает наличие экссудата. 2. Микроскопический анализ с использованием окрашивания. Готовят микроскопический препарат из поражённой ткани растения, для чего используют пограничные участки между поражённой и здоровой тканью. Проведение окрашивания (например, по Граму) облегчает распознавание бактериальных клеток в ткани растения-хозяина. 3. Микробиологический. Заключается в изоляции возбудителя из поражённых тканей на искусственные питательные среды. При этом необходимо установить патогенность изолятов бактерий, т.е. их способность вызывать на искусственно инфицированных растениях те же симптомы, какие были на исследуемом растении при естественном поражении. При этом действуют в соответствии с правилом Роберта Коха, названным триадой Коха. Метод включает три основных этапа: выделение возбудителя, заражение растения и снова выделение возбудителя. 4. Серологический. Сущность метода такая же, как при диагностике вирусов. Отличия серологической диагностики бактерий от диагностики вирусов и сложность анализа состоит в том, что у бактериальной клетки имеются не только белки, специфичные для вида, но и белки, общие для рода и семейства бактерий. Поэтому для получения специфичной антисыворотки используют лишь видоспецифичные белки (антигены). Наиболее часто применяются такие серологические методы как иммуноферментный анализ и реакция иммунофлуоресценции. В настоящее время доступны коммерческие диагностические препараты для обнаружения заражённости семян томата бактериальным раком. 5. Молекулярный. Среди нескольких диагностических методов, использующих полиморфизм молекулы ДНК бактерий, наиболее распространенным является амплификация (умножение) видоспецифичных последовательностей ДНК в ходе полимеразной цепной реакции (PCR). В ходе той реакции отдельные фрагменты ДНК, характерные только для одного вида бактерии, избирательно синтезируются ферментом полимеразой до количества, в тысячи и миллионы раз превышающего исходное число копий выбранного фрагмента ДНК. Далее, фрагмент обнаруживается с помощью электрофореза в агаровом геле или по флуоресценции исходного раствора. Метод отличается высокой чувствительностью (достаточно 10 г бактериальной ДНК), быстротой (до 2-3 часов), высокой надежностью. К числу недостатков относится высокая стоимость оборудования для проведения PCR и реактивов, а также необходимость предварительного изучения разнообразия ДНК ФПБ. 4.2.3. Общие методы защиты растений от вирусной инфекции Вирусы постоянно присутствуют в растениях, и их вредоносность проявляется, как правило, в стрессовых ситуациях, приобретая хозяйственное значение только при инфицировании сильнопатогенными штаммами. Растения самостоятельно могут защищаться от многих вирусов, но результат этой борьбы проявляется в виде точечных или обширных некрозов, мозаик, деформаций. В результате ухудшается качество продукции и снижается урожайность. Химические способы борьбы с вирозами пока недостаточно хорошо разработаны, т.к. размножение вирусов настолько тесно связано с обменом веществ растения-хозяина, что непосредственное избирательное воздействие какими-либо препаратами на самого патогена отрицательно отражается и на растительной клетке. Поэтому защита от вирусов сводится скорее к предупреждению заболеваний, вакцинации слабопатогенными штаммами вирусов или к снижению темпов развития вирусных эпифитотий различными агротехническими приемами. На практике применяют следующие способы борьбы с вирозами: 1. При вегетативном размножении проводят периодическую прочистку посадок маточных растений. Этот метод эффективен для борьбы с вирусами, имеющими хорошо различимые симптомы. 2. Обследование молодых растений и выбраковка пораженных растений с целью уничтожения первичных очагов инфекции. Тщательное обследование растений в период всходов, начала цветения и начала плодоношения. 3. Термотерапия позволяет резко снизить зараженность, а иногда и полностью избавить растения от вирусов. Этот метод можно использовать как для обеззараживания вегетативных органов, так и для борьбы с инфекцией внутри семян. Температурные режимы строго специфичны и рассматриваются ниже в соответствующих разделах. 4. Использование метода культивирования апикальных меристем позволяет избавиться от большинства возбудителей вирозов. Лучший эффект оздоровления от вирусных инфекций получают при комбинировании метода культуры верхушечных меристем с предварительной термотерапией или химиотерапией, при которой в питательную среду для культивирования меристем вводят антивирусные добавки (гликопротеины, полисахариды, нуклеиновые кислоты, антибиотики высших растений) или обрабатывают ими исходные растения-доноры меристем. 5. Борьба с растениями-резерваторами вирусов, с переносчиками инфекции. Сокращение запаса вирусов в объектах окружающей среды (в семенах и в самих растениях, борьба с переносчиками инфекции). 6. Использование иммунных сортов и гибридов. При этом селекционную работу следует проводить не только по признаку устойчивости к вирусу, но, желательно, и к его переносчику. Не меньшее значение имеет получение толерантных (выносливых) сортов, в которых системное распространение вирусов ограничено, понижена их концентрация. Толерантность зачастую приводит к бессимптомному течению заболевания, при этом продуктивность растений практически не снижается. 7. Стимулирование у растений неспецифического иммунитета с помощью элиситоров (индукторов). 8. Преиммунизация, или вакцинация. Известно, что вирулентные штаммы не вызывают симптомы заболевания, если растение предварительно было заражено слабопатогенным или авирулентным штаммом вируса. Подобная вакцинация использовалась ранее для защиты неустойчивых к ВТМ сортов и гибридов томата. Однако, в целом преиммунизация не получила широкого применения из-за возможности мутирования патогена, усиления его вредоносности при совместном заражении с другими патогенами и из-за ряда других причин. Однако в последние годы получены хорошие вакцины не только к ВТМ, но и к вирусу зеленой крапчатой мозаики огурца (Андреева и др., 2000). 9. Изменение генома растений за счет включения новых генов устойчивости, полученных от донора. При введении в клетки гена, отвечающего за синтез белка оболочки вируса табачной мозаики, он вызывает появление устойчивости табака к этому заболеванию. Так, трансгенные кабачки, несущие гены вирусных оболочек желтой мозаики кабачка и мозаики арбуза, не имели симптомов поражения вирусами, тогда как контрольные растения и трансгенные растения с одним геном имели явные повреждения (Аветисов, 1999). Проведенные полевые испытания устойчивых к вирусам растений томатов, картофеля и многих других культур, полученных при использовании этого подхода, показали его эффективность и перспективность дальнейших исследований в данной области. 10. Государственный и внутрихозяйственный карантин. При импорте растений в сертификационном свидетельстве должно быть подтверждено, что материал не содержит карантинных объектов. Эффективность мероприятий внешнего и внутреннего карантина в значительной мере зависит от надежности и быстроты методов идентификации вирусов. 11. Организационно-хозяйственные мероприятия включают дезинфекцию режущих инструментов и орудий труда в растворе формалина, перманганата калия, спирта или их тепловую обработку, т.к. многие экономически значимые вирусы передаются контактным путем; работа в сменной обуви и одежде; размещение дезинфекционных ковриков перед входом в теплицу; регулярное проведение визуальных обследований растений. 12. Ослабление симптомов заболевания за счет поддержания оптимального режима выращивания культуры, в том числе минерального питания. В период развития эпифитотии растения опрыскивают растворами микроэлементов, фосфорными и калийными удобрениями, которые стимулируют раннее созревание растений и как следствие – наступление возрастной устойчивости. Последние три способа вместе являются основой так называемых профилактических мероприятий. 4.3. Вироиды Это сравнительно новая группа вирусоподобных фитопатогенов. Фактически вироиды состоят из одной циклической молекулы РНК, которая способна реплицироваться в растении за счет биосинтетических механизмов растения-хозяина. Вироидная РНК состоит из 250-400 нуклеотидов и имеет уникальную структуру. Это – кольцевая молекула с высоким процентным содержанием спаренных оснований, вследствие чего вироиды устойчивы к высоким температурам (свыше 1000С) и химическим веществам (фенол, спирты и др.). Вироидные заболевания были известны ранее, но их рассматривали как вирусные или как болезни с невыясненной этиологией. Вироиды – высокоинфекционные патогены, способные передаваться механически и с прививкой, пыльцой и семенами, насекомыми и таким растением-паразитом, как повилика. Они инфицируют преимущественно культурные растения из класса двудольных. Эффективных средств борьбы с заболеванием практически нет. Эта группа патогенов в большей степени опасна для многолетних и вегетативно размножающихся растений. Распространению вироидных болезней способствует трудность выявления патогена в образцах исходного посадочного материала, в том числе ввозимого из-за рубежа. В селекционных и генетических работах возможна передача вироидов с пыльцой и семенами. Эти заболевания наносят ущерб цитрусовым, хризантеме, томату, огурцу, баклажану. Томат может инфицироваться вироидной веретеновидностью клубней картофеля (ВВКК), вироидом экзокортиса цитрусовых, а также вироидами томатов «планта мачо» и апикальной карликовости. В Голландии, а затем в других странах отмечено вироидное заболевание огурца – бледность плодов, которое заметно проявляется в летние месяцы на длинноплодных партенокарпических гибридах. В последние годы все чаще выявляется латентное поражение баклажана, бобов, огурца, вироидами экзокортиса цитрусовых и карликовости хмеля. В целом сведения о распространении и вредоносности вироидных болезней на овощных культурах пока малочисленны. Диагностику вироидов проводят с помощью растений-индикаторов, а также используют методы определения их нуклеиновых кислот: электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), молекулярную гибридизацию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Основная направленность защиты от вироидов – профилактические меры: использование здорового посадочного материала, дезинфекция инструментов, выбраковка зараженных растений и т.п. Важно учитывать, что растения, пораженные вироидами, нельзя освободить от инфекции методами апикальной меристемы.  перейти в каталог файлов | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |