|
Зміст:
10. Неспецифічні фактори захисту організму................................
11. Серологічні реакції (І заняття)....................................................
12. Серологічні реакції (2 заняття)...................................................
13. Серологічні реакції з мітками.....................................................
14. Вакцини та імунні сироватки......................................................
15. Сучасні методи мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань......................................................................................
|
.............4
.............10
.............14
.............20
.............26
.............33
|
Практичне заняття №10
Тема: «Неспецифічні фактори захисту організму від мікроорганізмів»
Актуальність теми:
В організмі людини постійно відбуваються складні процеси і явища, які направлені на підтримку функціональної цілісності організму, сталості (постійності) хімічного і клітинного складу внутрішнього середовища – тобто, гомеостазу. Захист організму від чужорідних агентів відбувається на двох рівнях: неспецифічної резистентності та специфічного імунітету. Перший – філогенетично більш давній рівень складається з неспецифічних факторів захисту (НФЗ), які діють проти будь-якого чужорідного агента.
До НФЗ відносяться захисні функції шкіри, слизових оболонок, лімфатичних вузлів, шлунковий сік, гідролітичні ферменти; продукція інгібіторів, лізоциму, інтерферону та інші; антагоністичні властивості мікрофлори людини; бактерицидні властивості крові: комплемент, бета-лізини, лейкіни, нормальні антитіла і інші речовини, які мають бактерицидну дію; фагоцитоз.
Механізми неспецифічної резистентності функціонують в організмі постійно і обумовлюють в випадках масивної мікробної чи (або) іншої дестабілізуючої дії запальну реакцію, однакову при різних збудниках.
При порушенні складових неспецифічної резистентності спостерігаються різні захворювання. Тому своєчасне визначення змін кількісного, якісного або функціонального стану різних факторів неспецифічного захисту дає можливість оцінити стан імунної системи людини, допомогти в діагностиці, профілактиці і терапії інфекційних і неінфекційних захворювань. Все це зумовлює актуальність теми заняття та спрямоване на формування позитивної мотивації її вивчення.
Конкретні цілі:
Оволодіти методикою визначення лізоциму в сироватці крові людини титраційним методом.
Здійснити облік реакції титрування комплементу в сироватці крові за 100% гемолізом, розглянути постановку і особливості цієї реакції, зробити висновки.
Ознайомитись з явищем незавершеного фагоцитозу в демонстраційних препаратах, які зроблені з уретральних виділень хворого на гонорею.
Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція).
Назви попередніх дисциплін
|
Отримані навики
|
Анатомія людини
|
Аналізувати інформацію про будову тіла людини, системи, що його складають, органи і тканини.
|
1
|
2
|
Гістологія, цитологія, ембріологія
|
Інтерпретувати мікроскопічну та субмікроскопічну структуру клітин.
|
Медична і біологічна фізика
|
Трактувати загальні фізичні та біофізичні закономірності, що лежать в основі біологічних процесів.
|
Медична біологія
|
Пояснювати на молекулярно-біологічному та клітинному рівні закономірності біологічних процесів.
|
Медична хімія
|
Трактувати загальні фізико-хімічні закономірності, що лежать в основі процесів розвитку клітин.
|
Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.
Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:
Термін
|
Визначення
|
1
|
2
|
Імунітет
|
Імунітет – це сукупність процесів і механізмів, які забезпечують сталість (постійність) антигенного складу організму і його захист від інфекційних та інших чужорідних для нього агентів.
|
Неспецифічні фактори захисту (НФЗ)
|
До неспецифічних факторів захисту, які еволюційно виникли першими, ніж специфічний імунітет, належать неспецифічні механізми, фізико-хімічні, клітинні, гуморальні, а також фізіологічні захисні реакції, які забезпечують збереження сталості внутрішнього середовища і відновлення порушених функцій макроорганізму. НФЗ діють постійно, швидко, проти будь-якого чужорідного агента. До НФЗ відносяться бар’єрна функція шкіри, слизових оболонок, лімфатичних вузлів, бактерицидні речовини рідин організму (слини, сироватки крові та ін.), видільна функція, температурна реакція, антагоністичні властивості нормальної мікрофлори та ін.
|
Лізоцим
|
Лізоцим – це фермент (ацетилмурамінідаза), який руйнує пептидополісахариди клітинної стінки бактерій, в першу чергу грампозитивних, у яких клітинна стінка до 90% складається з муреїну. Лізоцим синтезується макрофагами і забезпечує бактерицидні властивості крові, слини, сліз.
|
Комплемент
|
Комплемент – це складний комплекс білків крові, який складається з 9 фракцій, кожна з яких має певну властивість. Комплемент синтезується клітинами печінки і виконує ряд функцій: 1)викликає лізис мікробів і інших клітин; 2)бере участь в специфічних імунологічних реакціях, нейтралізації вірусів; 3)посилює фагоцитоз, хемотаксис, запалення.
|
1
|
2
|
Пропердин
|
Пропердин – це високомолекулярний (230 тис. дальтон) білок сироватки крові, який приймає участь в альтернативному шляху активації комплементу, знешкоджує деякі бактерії і віруси, стимулює фагоцитоз.
|
Фагоцитоз
|
Фагоцитоз – це найдавніша форма захисту організму, являє собою активне поглинання й перетравлення клітинами живих або вбитих мікроорганізмів чи інших сторонніх частинок, що потрапили до нього. Фагоцитарну функцію виконують два типи клітин: 1)мікрофаги (нейтрофіли, еозинофіли); 2)макрофаги рухливі (моноцити, гістіоцити тощо) і нерухливі (клітини селезінки, лімфатичної тканини, ендотеліоцити печінки, ендотелій кровоносних судин та ін.).
|
Незавершений фагоцитоз
|
Незавершений фагоцитоз – це фагоцитоз, при якому мікроорганізми поглинаються фагоцитами, але не гинуть і не перетравлюються, а іноді й розмножуються, викликаючи загибель фагоцитів.
|
Запальна реакція
|
Запальна реакція – це реакція, при якій із тканин вивільняються різні речовини (лейкотоксини, лейкопенічний фактор, гістамін, серотонін та ін.), під впливом яких активуються лейкоцити, які не дають розповсюджуватись бактеріям у тканині, крові і органах. Запалення зумовлює підвищення температури тіла, виникнення ацидозу й гіпоксії, що згубно діють на мікроорганізми.
|
Інтерферони
|
Інтерферони – це група індуцибельних низькомолекулярних білків, які здійснюють контрольно-регуляторні функції, направлені на збереження клітинного гомеостазу. Найважливішими з цих функцій є антивірусна, протипухлинна, імуномоделююча, антибактеріальна та радіопротективна. Інтерферон синтезується лімфоцитами, лейкоцитами, фібробластами, клітинами лімфатичних вузлів і поділяється на три типи: - (лейкоцитарний), - (фібробластичний) і -інтерферон (лімфоцитарний, або імунний). Індукторами синтезу інтерферону можуть бути віруси, бактерії, гриби, екстракти рослин, синтетичні сполуки, різні лікарські засоби, випромінювання та інше.
|
Білки гострої фази (БГФ)
|
Білки гострої фази – це велика група білків, які посилено продукуються в організмі під час виникнення запальних реакцій після інфікування чи ушкодження, при онтогенезі, вагітності і мають антимікробну дію, сприяють фагоцитозу, активації комплементу, формуванню та ліквідації запального вогнища. Основну масу БГФ складає С-реактивний білок,
|
1
|
2
|
|
сироваткові амілоїди А і Р. Інші БГФ – це фактори згортання крові, металозв’язуючі білки, інгібітори протеаз і деякі компоненти комплементу.
|
Бета-лізини
|
Бета-лізини – це термостабільні (руйнуються при температурі 65-70С) бактерицидні фактори, які виявляють найбільшу активність по відношенню до анаеробів і спороутворюючих аеробів.
|
Інгібітори вірусної активності
|
Інгібітори вірусної активності – це перший гуморальний бар’єр, який перешкоджає контакту вірусу з чутливими клітинами. Термостабільні інгібітори здатні інактивувати інфекційні, токсичні, гемаглютинуючі властивості інгібіторочутливих штамів вірусів. Термостабільні–блокують з’єднання віруса з рецепторами клітин хазяїна. Люди з високим рівнем інгібіторів в крові мають більшу стійкість до вірусних інфекцій.
|
Цитокіни
|
Цитокіни – це гормоноподібні медіатори міжклітинних взаємодій, які продукуються різними клітинами організму і здатні впливати на функції інших або цих же груп клітин. Цитокіни – пептиди або глюкопротеїди; регуляторами продукції цитокінів можуть бути інші цитокіни, гормони, простагландини, антигени і багато інших агентів, діючих на клітину.
|
Теоретичні питання до заняття:
Види імунітету, які обумовлюють захист організму від живих тіл та речовин, що несуть на собі ознаки генетичної чужорідної інформації.
Фактори неспецифічного захисту організму та їх особливості у дорослих та дітей.
Пріоритет вітчизняних вчених у відкритті факторів неспецифічного захисту організму.
Фагоцитоз. Клітини, що здатні до фагоцитозу. Стадії цього явища.
Комплемент, його компоненти. Активація комплементу. Способи його визначення.
Пропердинова система. Її природа, властивості та значення.
Лізоцим, його природа. Дія лізоциму на мікроорганізми та способи його визначення.
Чому нормальна мікрофлора віднесена до неспецифічних факторів захисту?
Типи інтерферонів. Їх роль в противірусному, протипухлинному імунітеті, регуляції імунних функцій організму.
Практичне значення визначення титру комплементу, лізоциму, фагоцитозу та інших показників неспецифічного захисту організму.
Практичні завдання, які виконуються на занятті:
Оволодіти методикою визначення лізоциму в слині людини титраційним методом.
Здійснити облік реакції титрування комплементу в сироватці крові за 100% гемолізом, розглянути постановку і особливості цієї реакції.
Ознайомитись з явищем незавершеного фагоцитозу в демонстраційних препаратах.
Зміст теми:
На практичному занятті студенти повинні оволодіти методикою визначення титру лізоциму в слині людини; розглянути постановку і особливості реакції титрування комплементу за 100% гемолізом, здійснити облік цієї реакції, яка дана в демонстрації; вивчити явище незавершеного фагоцитозу на демонстраційних препаратах. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.
Рекомендації для оформлення протоколу
5.1. Схема титрування лізоциму в слині
№ пробірки
інгредієнти, мл.
|
Дослідна
|
Контрольна
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
0,5% розчин NaCl
|
1 ,8
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
Досліджувана слина
|
0 ,2
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
|
Одержане розведення
|
1:10
|
1:20
|
1:40
|
1:80
|
1:160
|
1:320
|
|
2-х мільярдна завись M.lysodeikticus
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
Кінцеве розведення
|
1:20
|
1:40
|
1:80
|
1:160
|
1:320
|
1:640
|
|
1 мл
|
В термостат на 1 годину при температурі 37С (попередній облік). Кінцевий облік через 24 години утримання в термостаті при температурі 37С.
Титр лізоциму – це те найбільше розведення сироватки, яке ще здатне давати повний лізис бактерій (M.lysodeikticus)
|
Схема титрування комплементу в сироватці крові людини за 100% гемолізом.
 № пробірки
Інгре-
дієнти (мл)
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
Досліджувана сироватка в розведення 1:10
|
0,1
|
0,2
|
0,3
|
0,4
|
0,5
|
0,6
|
0,7
|
0,8
|
0,9
|
1,0
|
1,2
|
Фізіологічний розчин
|
1,4
|
1,3
|
1,2
|
1,1
|
1,0
|
0,9
|
0,8
|
0,7
|
0,6
|
0,5
|
0,3
|
Гемолітична система
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
В термостат на 40-50 хвилин при температурі 37С
|
Результат*
|
-Г
|
-Г
|
-Г
|
+Г
|
+Г
|
+Г
|
+Г
|
+Г
|
+Г
|
+Г
|
+Г
|
Примітка: *-Г – нема гемолізу; +Г – є гемоліз.
Гемолітична система – це суміш рівних об’ємів розведеної по трикратному титру гемолітичної сироватки та 3-5% зависі баранячих еритроцитів. Суміш витримують при 37С в термостаті 30 хвилин для сенсибілізації еритроцитів.
Титр комплементу – це найменша кількість досліджуваної сироватки, яка сприяє повному гемолізу доданої кількості сенсибілізованих еритроцитів.
5.3. Вивчити явище незавершеного фагоцитозу на демонстраційних препаратах.
6. Питання для самоконтролю.
Що вивчає імунологія?
Які є фактори неспецифічного захисту організму? Переваги і недоліки механізмів неспецифічної резистентності.
Який пріоритет вітчизняних вчених у відкритті факторів неспецифічного захисту організму?
Фагоцитоз. Клітини, що здатні до фагоцитозу. Види фагоцитозу. Як відбувається фагоцитоз?
Комплемент, його компоненти. У чому схожість і різниця двох шляхів активації комплементу? Які способи його визначення?
Пропердинова система. Яка природа, властивості та значення?
Що таке лізоцим; його природа? Як діє лізоцим на мікроорганізми? Які способи його визначення?
Дайте визначення поняття “цитокіни”. Їх імуномоделююча і захисна дія.
Що являють собою інтерферони? Назвіть основні різновиди, яка їх роль в противірусному, протипухлинному захисті та імуномоделюючій функції організму?
Практичне значення визначення комплементу, лізоциму, фагоцитозу та інших показників неспецифічного захисту організму.
Практичне заняття №11
Тема: «Серологічні реакції (1 заняття)»
1. Актуальність теми:
Методика лікування інфекційного захворювання визначається біологічними особливостями збудника. Тобто, лікар має не тільки поставити клінічний діагноз, але і визначити, який мікроорганізм викликав інфекцію. Етіологічна діагностика багатьох інфекційних захворювань основана на виділенні чистої культури збудника та визначенні її видової належності. Ідентифікація більшості бактерій та вірусів базується на визначенні специфічних антигенів, що потребує проведення серологічних реакцій. Метою такого дослідження є серологічна ідентифікація. Крім того, діагностика інфекційних захворювань може ґрунтуватись на виявленні специфічних мікробних антигенів безпосередньо в матеріалі хворого (крові, лікворі, сечі, ін.), особливо у випадку неможливості культивування збудників і ідентифікації їх іншими методами.
З іншого боку, імунна відповідь організму проявляється, зокрема, формуванням специфічних антитіл до кожного окремого виду збудника. Це дозволяє поставити етіологічний діагноз шляхом виявлення цих антитіл. Для цього проводиться постановка серологічної реакції з метою серологічної діагностики.
2. Конкретні цілі:
Ознайомитись із метою застосування серологічних реакцій (СР).
Вивчити препарати, що застосовуються з метод серологічної ідентифікації.
Ознайомитись із особливостями реакцій аглютинації та преципітації.
Оволодіти методикою постановки реакції аглютинації на склі та розгорнутої реакції аглютинації (РА).
Засвоїти методику постановки реакції преципітації (РП).
Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №10.
4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття
4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент на занятті:
Термін
|
Визначення
|
1
|
2
|
Серологічна реакція
|
Реакція специфічної взаємодії антигенів (Аг) та антитіл (Ат).
|
1
|
2
|
Реакція аглютинації
|
Аглютинація являє собою процес склеювання корпускулярних антигенів (бактерії, еритроцити) при дії на них специфічних антитіл у присутності електроліту з утворенням аглютинату. Аглютинація – це спосіб виявлення та кількісного визначення Аг або Ат, заснований на їх здатності до формування видимих конгломератів.
|
Реакція преципітації
|
Преципітація – це осадження дрібно-дисперсного або розчинного молекулярного Аг під впливом специфічної сироватки.
|
Серологічна ідентифікація
|
Серологічна ідентифікація – це визначення (ідентифікація) невідомого Аг за допомогою відомих Ат з використанням серологічних реакцій.
|
Імунна діагностична сироватка
|
Імунна діагностична сироватка (ІДС) – це стандартний препарат, що містить Ат до певної групи мікробів і використовується для постановки серологічної реакції.
|
4.2. Теоретичні питання до заняття:
Філогенетичні особливості формування імунної системи тварин.
Центральні та периферичні органи імунної системи, їх функції
Імунокомпетентні клітини, їх функції.
Дати визначення поняттям: антигени, антигенність
Антигенна будова бактеріальної клітини на прикладі E.coli
Будова та функції імуноглобулінів
Особливості взаємодії антигенів та антитіл
Серологічні реакції, відмінності простих та складних СР.
Цілі серологічних реакцій
Компоненти серологічної реакції, поставленої з метою сероідентифікації
Реакція аглютинації - визначення
Реакція преципітації - визначення
Імунні діагностичні сироватки, використання та етапи їх отримання.
4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:
Здійснити постановку реакції аглютинації на склі із адсорбованими сироватками, провести її облік.
Здійснити постановку реакції преципітації в рідкій фазі, провести її облік.
Поставити розгорнуту реакцію аглютинації з метою сероідентифікації культури бактерій.
Вивчити зразки імунних діагностичних сироваток.
5. Зміст теми.
На практичному занятті студенти мають ознайомитися із поняттям серологічних реакцій, визначити мету постановки та компоненти СР, ознайомитись із особливостями реакцій аглютинації та преципітації. Студенти проводять постановку реакцій аглютинації на склі із адсорбованими сироватками та преципітації в рідкій фазі, здійснюють облік. Розбирають особливості обліку розгорнутої реакції аглютинації, проводять постановку розгорнутої РА з метою серологічної ідентифікації. Виконані завдання студенти заносять в протокол та підписують його у викладача.
Рекомендації для оформлення протоколу.
5.1. Реакція аглютинації на склі
Матеріали:
Культура бактерій
Адсорбована імунна діагностична сироватка для РА на склі
0,5% розчин NaCl
Предметне скло, бак. петля
Хід роботи:
Облік результаті: Позитивна реакція – утворення аглютинату.
5.2. Розгорнута реакція аглютинації, яка поставлена з метою серологічної ідентифікації культури бактерій
Матеріали:
Культура бактерій (суспензія)
Імунна діагностична сироватка в робочому розведенні (1:50), титр - 1:3200
0,5% розчин NaCl
Пробірки, піпетки
Хід роботи:
Облік результатів. Позитивний результат – утворення аглютинату;
Попередній облік проводиться через 2 години, остаточний – через 18-24 години.
5.3. Реакція преципітації в рідкій фазі.
Матеріали: Антиген (преципітиноген);
Сироватка (преципітин) - №1, №2, контрольна (№3);
Піпетки;
Хід роботи:
Облік результатів.
Позитивна реакція – утворення кільця преципітація (помутніння).
5.4. Препарати імунних діагностичних сироваток.
6. Питання для самоконтролю.
Які органи імунної системи відносяться до центральних та периферичних, їх функції?
Які клітини відносяться до імунокомпетентних, їх функції?
Які клітини приймають участь у синтезі антитіл, характер їх кооперації?
Дати визначення поняттям: антигени, антигенність.
Які антигени має бактерія (на прикладі E.coli)?
Будова та функції імуноглобулінів.
Що таке серологічні реакції, відмінності простих та складних СР?
З якою метою може бути поставлена серологічна реакція?
Реакція аглютинації – визначення.
Реакція преципітації – визначення.
Які складові простих СР?
Які етапи включає в себе отримання імунних діагностичних сироваток?
Практичне заняття №12
Тема: «Серологічні реакції (2 заняття)»
Актуальність теми:
У захисті організму від чужорідних агентів вирішальну роль відіграють імунологічні механізми, які здійснюються антитілами (імуноглобулінами) та імунокомпетентними клітинами (лімфоцитами). В основі імунологічних механізмів є специфічна взаємодія антигену, що потрапив в організм, та антитіла, що утворилось у відповідь на потрапляння антигену. На використанні принципу взаємодії антигену та антитіла базуються всі імунологічні діагностичні реакції, які названі серологічними, оскільки антитіла знаходяться в сироватці крові. Застосування серологічних реакцій з метою серодіагностики інфекційного захворювання та з метою сероідентифікації збудників, що виділені від хворого, є необхідним для встановлення заключного діагнозу інфекційного захворювання. На занятті студентам надається можливість оволодіти методикою постановки основних серологічних реакцій (реакція аглютинації, реакція пасивної гемаглютинації, реакція гемолізу). Розуміння ролі антитілоутворення у формуванні імунної відповіді є необхідним підгрунтям для формування уявлення про складний механізм функціонування імунної системи та її ролі у розвитку імунозалежних патологій. Вміння обирати потрібні для діагностики інфекційного захворювання серологічні реакції, ставити їх та інтерпретувати отримані результати є важливим для формування у студентів клінічного мислення і розуміння суті патологічного процесу при інфекційних хворобах.
Конкретні цілі:
Аналізувати механізм взаємодії антитіл з антигенами
Знати закономірності серологічних реакцій
Інтерпретувати участь клітин імунної системи в імунній відповіді і фази імунної відповіді
Вміти проводити облік результатів розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації
Оволодіти методикою постановки реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної діагностики (реакція Відаля)
Оволодіти методикою постановки реакції імунного гемолізу
Засвоїти методику постановки реакції непрямої гемаглютинації
Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція). Дивись практичне заняття №10.
Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.
4.1.Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:
Термін
|
Визначення
|
1
|
2
|
Реакції лізису
|
Реакцією лізису називають розчинення антигену під дією антитіла у присутності комплементу. Свіжевиділена з організму людини імунна сироватка здатна до лізису, бо містить антитіла та комплемент. Якщо ж сироватка прогрівалась чи довго зберігалась, то лізис відбувається лише за умови додавання комплементу.
|
Реакція імунного гемолізу
|
Реакція імунного гемолізу базується на тому, що при імунізації тварин (частіше кролів еритроцитами барана) в сироватці крові з’являються специфічні захисні антитіла – гемолізини, які здатні в присутності комплементу порушувати зв’язок гемоглобіну зі стромою еритроцитів та викликати гемоліз (вихід гемоглобіну назовні еритроцита). Імунна сироватка, яка містить гемолізини, має назву гемолітичної сироватки. Такі сироватки випускають Інститути бактеріальних препаратів.
|
Сила гемолітичної сироватки
|
Сила гемолітичної сироватки визначається в титрах – це максимальне її розведення в об’ємі 0,5 мл, при якому спостерігається повний гемоліз 0,5 мл 3% зависі баранячих еритроцитів у присутності 0,5 мл комплементу, розведеного 1:10 та витримуванні пробірок впродовж години при 370 С.
|
Реакція непрямої гемаглютинації
|
Реакція непрямої гемаглютинації (РНГА) полягає в тому, що еритроцити барана чи іншого виду тварин, маючи здатність адсорбувати на собі антигени, стають “чутливими” (сенсибілізованими) до відповідної імуної сироватки. Під впливом специфічних антитіл сенсибілізовані еритроцити склеюються та випадають в осад, утворюючи на дні пробірки (або лунки) гемаглютинат. Відрізняючись високою специфічністю та чутливістю, РНГА дозволяє виявляти мінімальну кількість антитіл.
|
Система комплементу
|
Група сироваткових білків, які в процесі їх активації перетворюються в ефекторні молекули, що призводять до розвитку запалення (С3а, С5а, С4а), фагоцитозу (С3b)та руйнуванню клітин (С6-9). Таким чином, білки комплементу приймають участь у розвитку запальних реакцій, реакцій опсонізації та лізису клітинних мембран.
|
1
|
2
|
Діагностикуми
|
Діагностикуми – стандартні антигени, в ролі яких можуть бути суспензії інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині. Діагностикуми застосовуються при серологічній діагностиці інфекційних захворювань.
|
4.2. Теоретичні питання до заняття:
Діагностикуми, їх характеристика, принципи отримання і практичне використання.
Трьохкомпонентні та багатокомпонентні серологічні реакції (імунного лізису, реакція зв’язування комплементу, опсонофагоцитарна, непрямої аглютинації), їх суть, практичне використання.
Система комплементу, шляхи її активації, біологічне значення.
Реакція імунного гемолізу, механізм, практичне використання.
Оцінка результатів серологічних реакцій і висновки.
Реакції бактеріолізу, цитолізу, їх механізм та практичне використання.
4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:
Провести облік розгорнутої реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.
Поставити реакцію Відаля для серологічної діагностики черевного тифу.
Здійснити облік результатів РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу, зробити висновок
Провести облік результатів реакції імунного гемолізу, зробити висновок.
Вивчити зразки діагностикумів.
5. Зміст теми:
На практичному занятті студенти знайомляться зі складними серологічними реакціями, розглядають особливості постановки та компоненти реакції аглютинації і методику постановки реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з метою серологічної діагностики інфекційних захворювань. Студенти проводять облік реакції аглютинації, поставленої з метою ідентифікації культури бактерій; ставлять реакцію Відаля для діагностики черевного тифу; здійснюють облік РНГА, поставленої з метою серодіагностики черевного тифу; ставлять реакцію імунного гемолізу; вивчають зразки діагностикумів. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.
Рекомендації для оформлення протоколу.
5.1. Облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою серологічної ідентифікації культури бактерій.
Студенти проводять остаточний облік поставленої на попередньому занятті реакції аглютинації з метою ідентифікації культури бактерій. Ступінь позитивної реакції аглютинації позначається плюсами:
++++ - повна аглютинація, рідина прозора, а на дні значна кількість білого осаду;
+++ - рідина не зовсім прозора, осад менший;
++ - рідина непрозора, осад ще менший;
+ - рідина мутна, дуже незначний осад;
- - рідина рівномірно мутна, як в контролі антигену; осад відсутній. Результат в цьому випадку вважають негативним.
Відповідність між видом мікроба і діагностичною аглютинуючою сироваткою вважається достовірною при умові чітко вираженої реакції аглютинації в пробірках з розведенням сироватки в межах титру, але не менше 2/3 її титру при відсутності осаду в контролях сироватки і культури.
5.2. Постановка реакції аглютинації з метою виявлення антитіл в сироватці хворого з підозрою на черевний тиф та паратифи А та В.
Для проведення реакції беруть у хворого кров, одержують з неї сироватку і розводять ізотонічним розчином натрію хлориду від 1:50 до 1:800 за схемою. Як антиген в цій реакції використовують діагностикуми – суспензії із відомих убитих мікроорганізмів – черевного тифу та паратифів А та В.
СХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦІЇ АГЛЮТИНАЦІЇ З МЕТОЮ ВИЯВЛЕННЯ АНТИТІЛ В СИРОВАТЦІ КРОВІ ХВОРОГО
№ пробірки
Інгредієнти (в мл)
|
Дослідні
|
Контрольні
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
| Фізіологічний розчин |
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
---
|
Сироватка крові хворого в розведенні 1:25 (0,1 мл с-ки + 2,4 мл фіз.розчину)
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
1,0
|
В дез. Р-н.
---
|
1,0
|
Діагностикум
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
0,1
|
---
|
Отримані розведення сироватки
|
1:50
|
1:100
|
1:200
|
1:400
|
1:800
|
КД
|
КС
|
Штатив з пробірками поміщають в термостат при 370С. Попередній облік реакції проводять через 2 години, а остаточний – через 18-20 годин.
5.3. Принцип постановки та облік результатів реакції непрямої гемаглютинації (РНГА), поставленої з метою серологічної діагностики.
Суть реакції непрямої гемаглютинації полягає в тому, що еритроцити, на поверхні яких адсорбовані будь-які розчинні антигени, набувають здатності аглютинуватись при взаємодії з антитілами, специфічними до адсорбованого антигену. Еритроцити, що сенсибілізовані антигенами, називаються еритроцитарними діагностикумами. Найчастіше використовують еритроцити барана, яким властива висока адсорбуюча активність. Реакцію ставлять за такою схемою: в пробірках або лунках прогріту впродовж 30 хв. при 580 С досліджувану сироватку розводять послідовно від 1:10 до 1:320 в об’ємі 0,25 мл та додають по 2 краплі еритроцитарного діагностикуму. Реакцію супроводжують контролями: на спонтанну аглютинацію сенсибілізованих еритроцитів, контроль з нормальними еритроцитами, а також контролі діагностикумів з завідомо позитивною та негативною сироватками. Після легкого струшування пробірки або лунки витримують в термостаті 30-45 хв. при 370 С. Облік результатів реакції здійснюють після того, коли випадуть в осад еритроцити у відповідних контрольних пробірках. Достовірними результатами слід вважати відсутність гемаглютинації в контролях з нормальними, сенсибілізованими еритроцитами, з завідомо негативною сироваткою і наявність гемаглютинації і з завідомо позитивною сироваткою. Гемаглютинація в дослідних пробірках при відповідних контролях свідчить про наявність специфічних антитіл в досліджуваній сироватці. Результати оцінюють за зовнішнім виглядом осаду еритроцитів в лунках. В позитивному випадку (+) еритроцити рівномірно у вигляді “парасольки” покривають майже все дно пробірки або лунки. При негативному результаті (-) еритроцити осідають у формі компактного комочка – “гудзика”.
5.4. Постановка реакції імунного гемолізу.
Імунний лізис – це розчинення клітин (антигенів) під дією специфічних антитіл (лізінів) в присутності комплементу. В залежності від антигенів, що беруть участь в реакції лізису, вона одержала назву бактеріолізу, спірохетолізу, гемолізу тощо. Найчастіше використовується в лабораторній практиці реакція гемолізу як індикаторна система в реакції зв’язування комплементу. Для постановки реакції потрібні: 1) антиген – 3% суспензія еритроцитів; 2) антитіло – гемолітична сироватка проти еритроцитів барана; 3) комплемент – сироватка морської свинки, розведена 1:10; 4) ізотонічний розчин хлориду натрію.
 перейти в каталог файлов
| Образовательный портал
Как узнать результаты егэ
Стихи про летний лагерь
3агадки для детей |
Скачать 344 Kb.