ТЕМА 2 Иммунологич методы исследований Понятие об иммунограмме. В., Добровольская И. Н. Актуальность темы
 Скачать 404 Kb.
| Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей |
Определение показателей фагоцитоза: Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение приводит к хронизации воспалительного процесса и поддержанию аутоиммунного процесса, так, как при этом нарушается функция разрушения и выведения циркулирующих иммунных комплексов из организма. Фагоцитарное число: среднее количество микроорганизмов, поглощенных одним нейтрофилом крови. Характеризует поглощающую способность нейтрофилов. В норме составляет 5 – 10 микробных частей. Процент фагоцитоза – процент нейтрофилов, которые принимают участие в фагоцитозе. В норме составляет 65 – 95 %. Повышение показателей наблюдается при: антигенном раздражении в результате бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза; лейкоцитозе; аллергических реакциях; аутоиммунных заболеваниях; усилении антителозависимой цитотоксичности и реакции на донорский трансплантат. Снижение показателей наблюдается при: хронических воспалительных заболеваниях бактериальной и вирусной природы; врожденных дефектах фагоцитарной системы, синдроме Чедиака – Хигаси, болезнь Дауна, СКВ, коллагенозах, болезни иммунных комплексов, дефиците иммуноглобулинов, комплемента; лечении цитостатиками, иммунодепрессантами, облучением ионизирующей радиации; вторичных и первичных иммунодефицитах; новообразованиях; тяжелых ожогах, травмах, стрессах; кишечных и почечных синдромах потери белка; недостаточности питания; недостаточности фагоцитоза; хронизации воспалительного процесса. Спонтанный тест с НСТ (нитросиний тетразолий) позволяет оценить степень антигенного раздражения не активированных in vitro гранулоцитов крови. Он характеризует степень активации внутриклеточных антибактериальных систем. Принцип метода основывается на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под воздействием супероксиданиона, бразующегося в НАДФ – Н – оксидазной реакции, которая инициирует процесс стимуляции фагоцита. К фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, в норме при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. О нарушении метаболизма фагоцитов судят по снижению интенсивности синего окрашивания. При выявлении нарушений определяют уровень цитохрома b558 и других белков фагоцитов. Показатели НСТ – теста повышаются в начальном периоде острых бактериальных инфекций, тогда как при хроническом течении инфекционного процесса они снижаются. Санация организма от возбудителей сопровождается нормализацией показателя. Резкое снижение свидетельствует о декомпенсации противоинфекционной защиты и является прогностически неблагоприятным признаком. Показатель спонтанного НСТ – теста в норме составляет до 10 %. Повышение показателей наблюдается при: антигенном раздражении в результате бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции) при нормальной активности фагоцитоза; хроническом гранулематозе; лейкоцитозе; аллергических реакциях; аутоиммунних заболеваниях; усилении антителозависимой цитотоксичности. Снижение показателей наблюдается при: хронических воспалительных заболеваниях бактериальной и вирусной природы; врожденных дефектах фагоцитарной системы, синдроме Чедиака – Хигаси, болезни Дауна, СКВ, коллагенозах, болезнях иммунных комплексов, дефиците иммуноглобулинов, комплемента; лечении цитостатиками, иммунодепрессантами, облучением ионизирующей радиацией; вторичных и первичных иммунодефицитах, новообразованиях, тяжелых ожогах, травмах, стрессах; недостаточности фагоцитоза; хронизации воспалительного процесса. Индуцируемый НСТ – тест позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. Тест используют для выявления резервных возможностей внутриклеточных систем фагоцитов. При сохраненной внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах резко возрастает количество формазан-позитивних нейтрофилов после их стимуляции латексом. Снижение показателей стимулируемого НСТ – теста нейтрофилов ниже, чем на 20 %, а моноцитов ниже, чем на 30 % свидетельствуют о недостаточности фагоцитоза. Величина стимулируемого НСТ – теста в норме составляет 20 -40 %. Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов — наиболее информативный способ исследования опсонинов и функционального состояния фагоцитов. Техника проведения: 1) Лейкоциты, выделенные из крови больного, отмывают от сыворотки, подсчитывают и помещают в среду, содержащую сыворотку здорового или больного (источник опсонинов) и живые бактерии (обычно Staphylococcus aureus или Escherichia coli). 2) Смесь инкубируют при 37°C, отбирая пробы через 0, 30, 60 и 120 мин после начала инкубации. Для определения числа жизнеспособных бактерий каждую пробу быстро охлаждают и делают посев. 3) Через 2 ч после начала инкубации смесь центрифугируют. Лейкоциты и фагоцитированные бактерии оседают на дно, а нефагоцитированные бактерии остаются в надосадочной жидкости. В осадке и надосадочной жидкости определяют число жизнеспособных бактерий. Оценка результатов В норме в течение 2 ч фагоцитами поглощается и разрушается около 95% бактерий. При хронической гранулематозной болезни число разрушенных бактерий не превышает 10%, а внутри лейкоцитов обнаруживаются жизнеспособные бактерии. Присутствие живых бактерий в лейкоцитах при инкубации с сывороткой здорового свидетельствует о нарушении переваривания бактерий в отсутствие снижения способности к захвату бактерий. Повышенное содержание жизнеспособных бактерий в надосадочной жидкости при инкубации с сывороткой больного свидетельствует о дефиците опсонинов. Хемотаксис лейкоцитов Нарушение хемотаксиса может быть обусловлено дефектом фагоцитов, наличием ингибиторов хемотаксиса, дефицитом сывороточных или тканевых факторов хемотаксиса. Метод кожного окна С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм2 (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0,5—2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами. Исследование хемотаксиса in vitro основано на стимуляции выделенных из крови фагоцитов факторами хемотаксиса. Способность фагоцитов к направленной миграции можно оценить, поместив их в камеру Бойдена или чашку Петри с агарозой. Адгезия лейкоцитов Нарушение адгезии лейкоцитов обусловлено снижением экспрессии или отсутствием на их поверхности молекул адгезии, например CD11/CD18. Для определения молекул адгезии применяют проточную цитофлюориметрию. Отсутствие CD11/CD18 на нейтрофилах и моноцитах проявляется поздним отпадением пуповины, рецидивирующими бактериальными инфекциями, пародонтитом. Адгезию лейкоцитов можно также оценить по их способности прилипать к эндотелиальным клеткам. Иммунологические тесты, которые характеризуют клеточный иммунитет (Т – звено). Т-клеточный иммунитет оценивают по таким показателям: - Количество T-лимфоцитов; - Определение субпопуляций T-лимфоцитов Проточная цитометрия проводится с использованием моноклональных антител, связанных с флюоресцентными красителями производят окраску клеточных элементов крови. Моноклональные антитела имеют идентичную специфичность к мембранным антигенам, поэтому они сгруппированы и обозначены соответствующим номером кластера дифференцирования (CD). Клетки крови поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации. Все T-лимфоциты имеют поверхностный рецептор (кластер дифференцировки) CD2, зрелые лимфоциты – CD3, Т- хелперы CD4, Т- супрессоры/цитотоксические Т-лимфоциты - CD-8, NK-клетки - CD-16. Метод розеткоообразования Тест розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК, розеткообразующие клетки) применяют для выявления Т-лимфоцитов. Показано, что Е-рецепторы идентичны CD2, выявляемым моноклональными антителами и присутствуют на Т-клетках). Е-РОК тот. – общее количество Т-лимфоцитов, образовавших розетки. Е-РОК акт. – количество Т-лимфоцитов, образовавших активные розетки. Активные розетки образуются при четко определенном соотношении количеств эритроцитов и лимфоцитов, которое в несколько раз ниже, чем достаточно доя насыщения реакции, и без инкубации после центрифугирования. Е – РОК+ ГТ - количество Т-лимфоцитов, образовавших гравитационные розетки. Гравитационные розетки образуются при спонтанной седиментации клеток, т.е. без центрифугирования, в течение 1 ч). Нагрузочные тесты с лекарственными и другими веществами. В качестве такого дозированного воздействия обычно применяют инкубацию клеток в течение определенного времени с небольшими дозами, близкими к физиологическим количествам препаратов или без них. Наиболее часто подобные тесты ставят с лекарственными препаратами, в частности иммунокорригирующими (тималин, левамизол и др.) для того чтобы, определив действие препарата на клетки, прогнозировать эффективность его применения при лечении. В розеткообразовании наиболее часто используются следующие нагрузочные тесты: 1) инкубация клеток при 370С в течение 0,5-2 ч; 2) инкубация клеток в течение того же времени с растворами различных препаратов в концентрациях, близких к физиологическим, например с левомизолом, теофиллином, Т-активином, другими иммунокорригирующими препаратами; 3) инкубация клеток с различными дозами этих же препаратов. Нагрузочный тест Е-розеткообразовання с теофиллином является способом оценки функциональных субпопуляций лимфоцитов, поскольку инкубация с этим препаратом приводит к подавлению розеткообразования преимущественно клеток, обладающих супрессорной активностью, мало влияя на клетки с хелперной активностью. Теофиллин-резистентные Т-клетки - субпопуляция Т-лимфоцитов, обладающих хелперной (CD4) активностью, теофиллин-чувствительные Т-клетки - субпопуляция Т-лимфоцитов, обладающих супрессорной (CD8) активностью. Нулевые клетки (%) определяют по формуле 100 (%) – (Е-РОК + М-РОК). Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) Для стимуляции T-лимфоцитов in vitro используют следующие вещества. 1) Митогены — фитогемагглютинин, конканавалин A и др. — вызывают неспецифическую (не обусловленную связыванием с антигенраспознающими рецепторами) активацию T-лимфоцитов. 2) Растворимые антигены — антигены Candida albicans, столбнячный анатоксин — связываясь с антигенраспознающими рецепторами T-лимфоцитов памяти, вызывают специфическую активацию этих клеток. 3) Аллогенные клетки (в смешанной культуре лимфоцитов) активируют T-лимфоциты, поскольку несут на своей поверхности антигены HLA класса II. 4) Антитела к поверхностным антигенам T-лимфоцитов, участвующим в их активации, — CD2, CD3, CD43. 5) Химические вещества, например форболмиристатацетат (активирует протеинкиназу C) и иономицин (повышает содержание внутриклеточного кальция). Активацию T-лимфоцитов обычно оценивают по следующим показателям. 1) Пролиферация. 2) Выработка цитокинов — интерлейкинов-2, -4, -5, интерферона гамма и фактора некроза опухолей. 3) Экспрессия маркеров активации — CD25 и антигенов HLA класса II. 4) Цитотоксичность. Под действием митогенов, антигенов и аллогенных клеток покоящиеся T-лимфоциты активируются, превращаются в бластные клетки и начинают делиться. Спонтанная пролиферация лимфоцитов (бласттрансформация) бывает повышена у больных, перенесших многократные переливания крови, больных аллергическими и аутоиммунными заболеваниями, при бактериальных и вирусных инфекциях, а также у новорожденных. Оценку клеточного иммунитета проводят также с помощью кожных проб, основанных на аллергических реакциях замедленного типа. Антигены для проведения проб подбирают на основании данных анамнеза. Положительная реакция при проведении кожных проб позволяет исключить тяжелую недостаточность клеточного иммунитета, тогда как отрицательная реакция не имеет диагностического значения. Дозы антигенов для проведения кожных проб приведены в табл. 4.
При проведении этого исследования необходимо соблюдать следующие правила. 1. Следует удостовериться в активности антигена, для чего кожную пробу нужно сначала провести у здорового человека, чувствительного к нему. 2. Следует учитывать, что при проведении проб на фоне иммуносупрессивной терапии возможны ложноотрицательные результаты. 3. Следует выяснить, контактировал ли больной в прошлом с антигенами, используемыми при постановке проб, и если да, не было ли при этом местных или системных реакций. При тяжелых реакциях в анамнезе кожные пробы с данным антигеном не проводят или проводят с менее концентрированным антигеном. 4. Кожные пробы проводят следующим образом. - Для каждой инъекции используют отдельный стерильный туберкулиновый шприц объемом 1 мл и иглу 27 G длиной 13 мм. - В шприц набирают 0,1 мл раствора антигена, удаляют пузырьки воздуха. - Антиген вводят внутрикожно в предплечье или спину. - Сразу после введения антигена в месте инъекции должен появиться волдырь диаметром 5—10 мм. Если волдырь не появился, инъекция сделана не внутрикожно, а п/к. В этом случае антиген вводят повторно в другой участок кожи. - Место инъекции обводят, например шариковой ручкой. - Результаты оценивают через 24 и 48 ч. Если через 24 ч результат пробы отрицателен, можно вводить более концентрированный раствор антигена. - Для проведения кожных проб обычно используется коммерческий набор Мультитест CMI, состоящий из 7 антигенов: Candida albicans, Trichophyton spp., Proteus spp., столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина, стрептокиназы и очищенного туберкулина. Следует отметить, что оценка результатов исследования с применением этого набора часто бывает затруднена, поскольку при положительной реакции волдырь может быть небольшим (чуть более 2 мм).  перейти в каталог файлов | Образовательный портал Как узнать результаты егэ Стихи про летний лагерь 3агадки для детей | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||