Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу Цитогенетика

73
Для использования в качестве красителей во флуоресцентной микроскопии, флуорохромы должны обладать также определенным химическим сродством к различным клеточным компонентам, что и позволяет с их помощью проводить микроскопический анализ распределения и динамики биологических макромолекул и внутриклеточных структур. Например, некоторые флуорохромы (иодистый пропидий,
DAPI, акридиновый оранжевый, Хехст 33258) селективно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и используются для визуализации хромосом и ядер, а также
РНК. Они часто используются в сочетании с другими флуорохромами для удобства идентификации клеток. Некоторые флуорохромы меняют свои спектральные свойства при взаимодействии с различными ионами и малыми молекулами и используются для измерений внутриклеточного pH, концентрации Ca++ и т.п. Однако чаще всего флуорохромы используются в качестве меток, присоединенных к антителам, которые и определяют специфичность связывания флуорохрома с исследуемыми молекулами
(см. Главу 5). Наконец, с при помощи методов генетической инженерии можно присоединить к гену исследуемого белка фрагмент, кодирующий флуоресцентный белок и экспрессировать полученные конструкции в живых клетках. Этот подход позволяет анализировать локализацию и динамику исследуемых белков (или субклеточных структур, в состав которых он входит) при помощи флуоресцентной микроскопии непосредственно в живых клетках.
Флуоресцентный микроскоп.
Специализированные модели микроскопов, предназначенные для наблюдения флуоресценции, содержат систему светофильтров, позволяющих, благодаря Стоксову сдвигу, эффективно разделить возбуждающий и испускаемый свет и таким образом наблюдать раздельно свечение различных флуорохромов. Эта система состоит как минимум из двух компонентов:
- возбуждающего светофильтра, располагающегося между источником света и объектом и пропускающего только свет определенной длины волны, соответствующей максимуму поглощения данного флуорохрома;
- барьерного светофильтра, располагающегося между объектом и окулярами или фотокамерой, и отражающего все длины волн (включая возбуждающий свет) кроме тех, которые соответствуют спектру испускания используемого флуорохрома.

74
Барьерные фильтры могут быть узкополосными (band-pass), т.е. пропускающими свет в узком диапазоне, или односторонними (long-pass), пропускающими весь свет длинее определенной длины волны. Поскольку спектры излучения разных флуорохромов могут частично перекрываться, то применение band-pass фильтров позволяет более качественно разделить их сигналы и снизить фон, тогда как long-pass фильтры пропускают больше света.
Поскольку интенсивность испускаемого флуорохромами света гораздо ниже, чем интенсивность возбуждающего флуоресценцию света падающего на препарат, в современных моделях флуоресцентных микроскопов для более эффективного разделения этих двух световых потоков реализован режим эпифлуоресценции, когда возбуждающий свет падает на препарат сверху. В этом случае объектив играет роль конденсора, фокусирующего свет на препарате. Кроме того, в оптической схеме используется дополнительный элемент — светоделительное
зеркало, располагающееся под углом 45
о к направлению световых потоков и отражающее свет коротковолнового диапазона, но пропускающее более длинноволновые фотоны.
Длина волны отсечения подбирается для каждого флуорохрома индивидуально, чтобы направлять возбуждающий свет от источника освещения на препарат и пропускать испускаемый свет в окуляры микроскопа или на светочувствительную матрицу камеры. В современных моторизованных микроскопах возможна автоматическая смена светофильтров, что облегчает наблюдение и фотографирование распределения нескольких флуорохромов в одном препарате и позволяет анализировать их взаимное расположение. Для локализации нескольких флуорохромов также применяются многополосные запирающие фильтры и светоделительные зеркала (так называемый набор Пинкеля). В этом случае переключение с одного флуорохрома на другой осуществляется только за счет смены возбуждающих светофильтров.
Для возбуждения флуоресценции необходимы источники света с высокой яркостью. Чаще всего для флуоресцентной микроскопии используются ртутные лампы высокого давления, ксеноновые лампы или лазеры. Ртутные лампы обладают неравномерной интенсивностью свечения в разных областях спектра, давая узкие пики, однако наиболее широко распространенные флуорохромы специально создавались для использования с ртутными лампами, поэтому максимумы их

75
спектров поглощения хорошо соответствуют максимумам интенсивности свечения ртутных ламп. Из-за небольшого срока службы (100-300 часов) и падения интенсивности свечения со временем ртутные лампы в последнее время заменяются металло-галогенными, рабочий ресурс которых при незначительных колебаниях яркости значительно больше. Ксеноновые лампы имеют более гладкий спектр излучения, что делает их пригодными для использования со многими флуорохромами. К преимуществам лазерных источников света для флуоресцентной микроскопии следует отнести высокую яркость и практически монохроматичное излучение, а также малый размер источника и слабое расхождение пучка света. Эти характеристики особенно успешно применяются в лазерной конфокальной сканирующей микроскопии. Лазерные источники света весьма дороги, однако введение в практику диодных лазеров позволило существенно удешевить конструкцию и сделать такие осветители более доступными.
Помимо специальных фильтров и источников света, флуоресцентная микроскопия предъявляет особые требования к оптике и системам детекции флуоресценции. Из-за низкой эффективности процесса флуоресценции и больших потерь энергии в оптической системе лишь около 1% энергии от источника освещения доходит до препарата, а на детектор попадает не более 20% испускаемого света. Поэтому флуоресцентные микроскопы оборудуют объективами с максимальной числовой апертурой, что позволяет наиболее полно собирать свет, испущенный флуорохромами. При слабой флуоресценции предпочтительнее использовать объективы типа ахромат или флуорит, которые содержат меньше оптических элементов, чем план-апохроматы, и поэтому снижение интенсивности света при прохождении через такие объективы меньше. Несмотря на нескорректированные аберрации, эти объективы предпочтительнее для исследования живых клеток, когда проблемы фототоксичности (изменения физиологии клетки под действием интенсивного освещения) и регистрации подвижных структур требуют применения коротких экспозиций. Однако для исследования фиксированных клеток и достижения максимального разрешения объективы типа план-апохромат являются незаменимыми.
В современных микроскопах для детекции флуоресценции чаще всего используют высокочувствительные CCD-камеры (Charge-Coupled Device, прибор с зарядовой

76
связью), которые практически полностью вытеснили фотопленку. При сопоставимом разрешении, ССD-камеры более чем на два порядка превосходят фотопленку по чувствительности. Однако более важны для флуоресцентной микроскопии является не столько чувствительность ССD-камеры, сколько уровень шумов, генерируемых в процессе ее работы. Темновой шум, возникающий в результате теплового движения атомов в светочувствительном элементе CCD-камеры, обычно компенсируется глубоким многоступенчатым охлаждением (до температуры -30
о
С и ниже). Шум, возникающий в результате работы электронных компонентов по преобразованию накопленных на матрице камеры зарядов в цифровой сигнал, пропорционален скорости этого преобразования, поэтому при медленном считывании информации с матрицы шум существенно снижается. Сложнее всего избавиться от шума от попадания на светочувствительные элементы случайных фотонов. Считается, что для надежной детекции соотношение сигнал/шум должно быть не менее 3. Хотя теоретически ССD-камеры способны детектировать одиночные фотоны, на практике минимальный значимый уровень сигнала составляет около 8 фотонов.
В зависимости от направления хода лучей и, соответственно, в зависимости от положения объектива и конденсора, различают два типа флуоресцентных микроскопов. Если объектив находится над преператом, то микроскоп называют прямым, а если объектив находится под препаратом, то микроскоп называют инвертированным. В настоящей работе будет использован инвертированный микроскоп.
2. Экспериментальная часть.
Практическая работа: Изучение структуры хроматина и ядерной оболочки в процессе митотического деления клеток.
Цель работы: овладение практическими навыками работы на флуоресцентном микоскопе.
Объект исследования: клетки СПЭВ, экспрессирующие белок ядерной оболочки ламин А, меченый GFP (зеленым флуоресцирующим белком).
Приборы и реактивы: инвертированный флуоресцентный микроскоп, предметные стекла, пинцет, 15-мл пробирки с завинчивающейся крышкой, клетки СПЭВ-ламин А-
GFP, растущие на покровных стеклах в чашке Петри, 37% раствор пара-

77
формальдегида, 10хФСБ (фосфатно-солевой буфер , pH 7.4), ДАПИ (водный раствор 1 мг/мл), Мовиол.
Последовательность экспериментальных операций:
1. В 15-мл пробирке приготовить 10 мл 3.7% раствора параформальдегида в
ФСБ. Для этого к 8 мл дистиллированной воды добавить 1 мл 37% параформальдегида и 1 мл 10хФСБ и перемешать переворачиванием пробирки.
2. Слить культуральную среду из чашки с клетками и дважды ополоснуть клетки теплым (37
о
С) ФСБ.
3. Налить в чашки приготовленный раствор формальдегида и фиксировать клетки в течение 10-15 мин при комнатной температуре.
4. Промыть клетки ФСБ 2 раза по 5 мин.
5. Приготовить 5 мл рабочего раствора ДАПИ (0.1 мкг/мл) в ФСБ. Окрашивать клетки в течение 10 мин. Ополоснуть ФСБ.
6. Взять из холодильника (-20
о
С) пробирку с Мовиолом и нагреть ее до комнатной температуры, Мовиол должен расплавиться и стать прозрачным.
Нанести 40-50 мкл Мовиола на предметное стекло. Взять покровное стекло с клетками пинцетом за край, прикоснувшись краем стекла к фильтровальной бумаге промокнуть излишки жидкости и положить стекло клетками вниз на каплю Мовиола. Осторожно удалить избыток Мовиола по краям стекла фильтровальной бумагой, стараясь не двигать стекло. Оставить стекло в горизонтальном положении в темноте до застывания Мовиола (около 1 часа при комнатной температуре).
7. Проверить рукой температуру домика лампы. Если домик теплый, то необходимо выяснить, когда была выключена лампа. Категорически
запрещается включать ртутную лампу снова, до того момента, как она
полностью остыла (минимум 20 минут поле выключения). Нарушение
этого правила может привести к взрыву лампы и повреждению оптики!
Включить источник питания ртутной лампы микроскопа. Убедиться, что лампа зажглась, и включить микроскоп, затем камеру.

78
8. В инвертированном флуоресцентном микроскопе установить объектив х63 в рабочее положение и нанести на линзу каплю иммерсионного масла. Не
касаться пипеткой линзы объектива!
9. Поместить предметное стекло клетками вниз на предметный столик и поднять объектив при помощи макровинта до прикосновения стекла к капле масла.
10. Установить в оптический путь фильтры для ДАПИ, передвигая каретку с фильтрами в нужное положение. Переключить оптический путь на окуляры и наблюдая препарат в окуляры, продолжать поднимать объектив при помощи микровинта до появления резкого изображения ядер, светящихся синим светом.
11. Перемещая столик в горизонтальной плоскости, найти митотические клетки.
Сфотографировать изображение митотической клетки в канале ДАПИ, затем переместить каретку фильтров в положение FITC и сфотографировать то же поле зрения в канале зеленой флуоресценции. Долгое наблюдение препарата приводит к постепенному выцветанию флуоресценции, поэтому фотографировать надо сразу после смены фильтров и корректировки фокуса.

79
Глава 7.
Электронная микроскопия.
1. Теоретическая часть.
Оптическая микроскопия в ее классическом варианте не позволяет анализировать объекты, размеры которых меньше половины длины волны света (т.е. примерно 200 нм, см. Главу 1). В то же время, большинство субклеточных структур имеет размеры, не превышающие нескольких десятков нанометров. Поэтому изобретение электронной микроскопии ознаменовало собой революционный прорыв в области исследований морфологии нанообъектов. Электронная микроскопия основана на принципе Де Бройля, согласно которому любые частицы обладают волновыми свойствами и длина волны их обратно пропорциональна массе частицы и ее энергии.
Электроны имеют отрицательный заряд, что позволяет управлять их движением при помощи регулируемого магнитного поля, фокусируя пучок электронов подобно тому, как пучок света фокусируется стеклянными линзами светового микроскопа. Для электронов с энергией 200 кЭв длина волны будет около 2.5х10
-12
м (0,0025 нм), следовательно теоретическое разрешение микроскопа при использовании таких электронов будет около 0,001 нм. Для сравнения напомним, что расстояние между ядрами атомов водорода и кислорода в молекуле воды равно 0,099 нм. Однако максимального разрешения, которое теоретически может быть получено при использовании электронов, в настоящее время достигнуть не удается. В первую очередь, это связано с тем, что качество электронных линз, преобразующих пучок электронов, пока существенно ниже, чем качество оптических линз, используемых в световой микроскопии для преобразования пучка фотонов. Кроме того, для биологических объектов, существенное снижение реально достигаемого разрешения происходит из-за недостаточно высокой их электронной плотности.
Тем не менее, постоянный прогресс как в области разработки новых типов линз, источников электронов, детекторов электронов и т.д. позволяет получать все более высокое разрешение при работе с этим типом приборов. Этот прогресс существенно раздвинул сферу применения просвечивающих электронных микроскопов, делая его ценным инструментом для исследователей, работающих в области биоинженерии и биотехнологии.

Просвечивающий электронный микроскоп состоит из элементов, эквивалентных элементам, составляющим световой микроскоп (Рис.1), только вместо источника света в этих приборах используется источник электронов – электронная пушка. катод анод напряжение
80-120 кВ
80
переходная вакуумная камера первая и вторая конденсорные линзы первая вторая и диафрагмы конденсора исследуемый образец на держателе флуоресцентный экран боковая цифровая камера линза диафрагма объектива и нижняя цифровая камера фотокаме или ра проекционная линза промежуточная линза
Рис. 1. Принципиальная схема электронного микроскопа.

81
Катод представляет собой либо тонкую вольфрамовую проволоку (диаметр 0.1 мм), изогнутую в виде буквы V, либо кристалл гексаборита лантана. Катод находится под высоким напряжением от 80 до 120 киловольт относительно анода, который заземлен. Вследствие разницы потенциалов между катодом и анодом электроны разгоняются и направляются вниз по колонне микроскопа.
Пучком электронов управляют при помощи магнитных линз. Конденсорные линзы необходимы для равномерного «освещения» объекта электронами, объективная линза формирует первичное изображение, а промежуточная и проекционная линзы увеличивают первичное изображение до удобного для наблюдения или фотографирования размера. Изображение, формируемое электронами, может быть сфотографировано, если электроны попадают на фотопластинку или на матрицу цифровой камеры, либо изучено визуально, если электроны падают на специальный флуоресцирующий экран. Цифровые камеры могут располагаться или по ходу электронного пучка до флуоресцирующего экрана («боковые» камеры), или под ним
(«нижние» камеры), как и фотокамеры.
Необходимо обратить внимание на то, что, если в оптическом микроскопе для получения разных увеличений используются объективы разного увеличения, в электронном микроскопе объективная линза всего одна, и именно она определяет разрешение микроскопа. Увеличение конечного изображения меняется с помощью промежуточных линз и проекционной линзы.
Важным элементом электронного микроскопа является вакуумная система.
Поддержание высокого вакуума в колонне микроскопа необходимо для достижения максимального разрешения, т.к. в результате столкновения с молекулами газов электронный пучок может рассеиваться. С другой стороны, в высоком вакууме срок службы катодов существенно возрастает из-за отсутствия окисления. Наконец, в вакууме замедляется разрушение образцов, поскольку при взаимодействии с пучком электронов молекулы газа ионизируются и оседают на образце. В стандартных микроскопах поддерживается вакуум 10
-9
-10
-10
атм.
Подготовка образцов для наблюдения в электронный микроскоп.
В отличие от оптических микроскопов, в электронных микроскопах образцы подвергаются сильному радиационному воздействию и могут им повреждаться.

Кроме того, биологические структуры должны быть стабилизированы с максимальным сохранением нативной организации. Поэтому для электронной микроскопии биологических объектов важнейшее значение имеет процедура подготовки образца.
Толщина объектов, которые можно наблюдать в электронный микроскоп не превышает, обычно, 100 нм. Это связано с тем, что электроны рассеиваются в результате столкновений с атомами образца, и в результате разрешающая способность прибора сильно снижается. К тому же в толстых образцах часть электронов поглощается и их энергия переходит в тепло. Неравномерный нагрев образца приводит к его деформации и повреждению. Для преодоления этих проблем используют более высокое ускоряющее напряжение и охлаждение образцов. Так называемые мегавольтные микроскопы (с ускоряющим напряжением до 10 6
вольт) позволяют наблюдать образцы толщиной в несколько микрон. Однако в наиболее распространенных приборах с ускоряющим напряжением 100 кВ целиком можно наблюдать только очень мелкие объекты: макромолекулярные комплексы, вирусы и некоторые бактерии. В других случаях приходится применять технику ультратонких срезов. Для этого используются специальные приборы – ультрамикротомы.
82
Рис. 2. Различные типы сеточек для электронномикроскопических образцов.
Объекты помещают в микроскоп на поддерживающей металлической сеточке, на поверхности которой нанесена пленка, которая практически прозрачна для

электронов. Сетки имеют стандартный диаметр 3.05 мм, однако могут отличаться материалом, из которого они изготовлены (медь, никель, золото), размером, числом и формой ячеек (Рис. 2).
Наиболее распространены медные сетки, а никелевые и золотые используют в случае необходимости обработки препаратов реагентами, взаимодействующими с медью.
2 x 1.5 mm
2 x
2 x 1mm
Au
Ni
Cu
C
Ni
0.75 mm
u +Pd
Рис. 3. Бленды (one-slot-grids) из различных материалов: золота, никеля, меди без
покрытия и со специальным покрятием из палладия. Размер «окна» также может
быть различным.
Для исследования многочисленных мелких объектов (макромолекулы, вирусы и т.п.) используют сетки с большим количеством ячеек, т.к. объекты целиком помешаются внутри ячееек, а повреждение пленки в отдельных ячейках не влияет на наблюдение объектов в соседних с ними. Для крупных объектов или при изучении серийных срезов предпочтительнее использовать бленды (сетки с одной большой ячейкой), чтобы избежать вероятности попадания частей объекта на перекрестья
83

сеток (Рис. 3). Однако при работе с блендами надо проявлять большую осторожность, чтобы не повредить пленку.
Поддерживающая пленка изготавливается из полимера формвара, растворенного в дихлорэтане или хлороформе. Чистое стекло погружают в раствор формвара, вынимают и дают стечь избытку раствора на фильтровальную бумагу.
После высыхания раствора в течение нескольких минут на стекле образуется тонкая пленка формвара. Ее снимают погружением стекла в воду под углом 45
о
(Рис. 4).
Пленка отделяется от стекла и переходит на поверхность воды. На плавающую пленку раскладывают сетки и опускают на нее чистое стекло или кусок парафильма.
Прилипшие к стеклу сетки вынимают из воды и высушивают.
Рис. 4. Отделение формваровой пленки от стекла на поверхности воды (слева)
и раскладка бленд на поверхность этой пленки (справа).
Методы изучения макромолекулярных комплексов
Биологические объекты состоят в основном из легких атомов, которые слабо взаимодействуют с электронами, что обуславливает их низкий контраст при наблюдении в электронный микроскоп. Поэтому важным этапом подготовки образца является его контрастирование. Для контрастирования используют соли тяжелых металлов. Различают позитивное и негативное контрастирование (Рис. 5)
Метод негативного контраста – используется для изучения изолированных объектов (вирусов, клеточных органелл, макромолекул и их
84

комплексов). При использовании этого метода контраст создается благодаря распределению контрастирующей жидкости вокруг объекта или во внутренних полостях его, тогда как сам объект остается электронопрозрачным. В результате можно наблюдать изображение светлого объекта на темном фоне (негатив). Для негативного контрастирования сначала суспензию исследуемых частиц наносят на сетку с пленкой-подложкой. После адсорбции частиц на пленке избыток суспенции отсасывают фильтровальной бумагой и наносят каплю контрастирующего раствора
(2% уранилацетат, 2% молибдат аммония). Через несколько секунд избыток краски удаляют и сетки высушивают.
85
капля контрастирующей жидкости
Рис. 5. Выявление структуры образца при использовании позитивного контраста
(фракция выделенных центриолей после контрастирования фосфорновольфрамовой
кислотой) и негативного контраста (препарат вируса табачной мозаики после
контрастирования молибдатом аммония).
Подготовка клеток для ультраструктурного изучения.
В этом разделе будут последовательно описаны основные этапы подготовки образцов для исследования в электронный микроскоп на примере культивируемых клеток животных.
образец
позитивный
контраст
негативный
контраст

86
Фиксация.
Все задачи ультраструктурного изучения клеток и тканей можно разделить на две группы – изучение морфологии клеток и распределения в клетке определенных белков или нуклеиновых кислот c помощью специфического мечения. В каждом случае протокол фиксации будет различным.
В морфологических исследованиях чаще всего используют три фиксирующих агента – формальдегид, глутаровый альдегид и четырехокись осмия. Формальдегид имеет небольшие размеры и очень быстро проникает в клетки. В водных растворах он находится в гидратированной форме (Рис. 6). Формальдегид взаимодействует преимущественно с белками, но качество фиксации недостаточно высокое из-за короткой длины образующихся сшивок.
В результате макромолекулы стабилизируются достаточно хорошо, но межмолекулярные сшивки образуются неэффективно. Намного лучшей фиксации можно добиться при использовании диальдегида – глутарового альдегида, который образует многочисленные межбелковые связи, фактически сшивая все внутриклеточное содержимое в довольно плотную сеть. Скорость проникновения глутарового альдегида меньше, чем у формальдегида, но при использовании культивируемых клеток или очень маленьких кусочков ткани (менее 1 мм
3
) этот фактор не играет существенного значения. Иногда используют смесь формальдегида и глутаральдегида. Первый обеспечивает быструю префиксацию, а второй — жесткую последующую стабилизацию биологических структур.
Для фиксации мембран, липидных гранул, липосом и т.п. используют четырехокись осмия, т.к. альдегиды плохо взаимодействуют с липидами. Это фиксирующее вещество медленно проникает в ткани, поэтому, как правило, проводят последовательную фиксацию глутаровым альдегидом, а затем четырехокисью осмия.
При фиксации клеток и тканей важно обращать внимание на рН и тоничность буферного раствора, в котором разводят фиксирующие вещества. Чаще всего используют либо 0.1 М фосфатный буфер Зеренсена, либо какодилатный буфер с рН
7.2-7.4.

87
Рис. 6. Основные фиксаторы, используемые в электронной микроскопии.
Обезвоживание и заключение в заливочные среды. Для изготовления качественых ультратонких срезов материал должен быть достаточно твердым и гомогенным по плотности. Это достигается либо замораживанием объектов после фиксации (метод Токуясу), либо пропиткой образца специальной заливочной средой с ее последующей полимеризацией. Наиболее распространенные заливочные среды на основе эпоксидной смолы (Эпон) гидрофобны, поэтому перед заключением в смолу образцы необходимо обезводить и перевести в органический растворитель (спирт, ацетон, пропиленоксид). Обезвоживание следует проводить постепенно, чтобы избежать сморщивания клеток, поэтому его проводят в несколько этапов, постепенно повышая концентрацию органического растворителя (например, используют спирты в концентрации 50%, 70%, 80%, 96%). После обезвоживания образец постепенно пропитывают смесью растворителя и заливочной среды, что позволяет постепенно заменить растворитель на смолу. При этом надо учитывать, что мономеры смолы
C
H
H
C
H
H
C
H
H
C
H
O
C
H
O
Глутаральдеги д
OH
H
C
H
HO
H
C
H
O
+
+
H
H
O
O
H
H =
Формальдегид
Os
O
O
O
O
Тетраоксид о
о с
с м
м и
и я
я

88
имеют больший размер и обладают заметно большей вязкостью, а значит, этот процесс может потребовать значительного времени.
Затвердевание эпоксидных смол происходит при нагревании. Образцы, пропитанные смолой, инкубируют сначала при 37
о
С в течение суток, чтобы снизить вязкость смолы и добиться ее более равномерного распределения в образце (в процессе этой инкубации из образца испаряются также остатки растворителя), а затем при 60
о
С в течение как минимум двух суток до полной полимеризации. Материал, заключенный в эпоксидные смолы, хорошо режется и демонстрирует оптимальную сохранность ультраструктуры. Однако для исследований локализации специфических молекул (например, методами иммуноцитохимии) эта смола не очень пригодна из-за своей гидрофобности. В этом смысле акриловые смолы (LR White, Lowicryl) обладают серьезным преимуществом: они гидрофильны и водорастворимые реагенты могут частично проникать внутрь среза, увеличивая объем материала, доступного для реакции, они также обладают пониженной вязкостью и способностью полимеризоваться при низкой температуре под действием ультрафиолетового облучения. В этих условиях не происходит денатурации белков, а значит антигенные детерминанты лучше сохраняются.
2. Экспериментальная часть.
Практическая работа № 1. Изучение вирусных частиц с помощью метода негативного контраста.
Все методы, используемые в электронной микроскопии требуют большой аккуратности. Необходимой предпосылкой успеха является правильная организация рабочего места. Особое внимание следует обратить на чистоту и хорошее освещение.
Существует два способа проведения окраски методом негативного контраста. В первом случае капли суспензии и красителя наносят на парафильм, а затем сетки или бленды перекладывают с одной капли на другую. При выполнении этой практической работы будет использован второй способ - капли суспензии наносятся на сетки, зажатые в пинцеты.
Цель работы: овладение методом негативного контраста.
Объект исследования: препарат вируса гриппа.

89
Приборы и реактивы: отцентрифугированный на максимальной скорости раствор молибдата аммония, кусочки фильтровальной бумаги, микропипетка и чистые кончики для нее; электронные пинцеты, сеточки, покрытые формваровой пленкой.
Меры безопасности при проведении работы: большинство веществ, используемых при проведении этих процедур, являются ядовитыми, поэтому работать необходимо в халате и в перчатках и выполнять все манипуляции с образцами в вытяжном шкафу.
Последовательность экспериментальных операций:
1. Зажать сетки в пинцеты и расположить их на небольшом возвышении (например, на крышке от чашки Петри).
2. На каждую сетку нанести по 10 мкл изучаемой суспензии. Через 30 секунд каплю удалить, коснувшись края сетки куском фильтровальной бумаги.
3. Если суспензия была приготовлена на каком-либо буфере с высокой ионной силой, промыть поверхность сетки, нанеся на ее поверхность 10 мкл дистиллированной воды
(или 5 мМ Tris-буфера), которую немедленно удалить, коснувшись края сетки куском фильтровальной бумаги. Эту процедуру повторить 3 раза.
4. Нанести на сетку 10 мкл раствора молибдата аммония и через 20 секунд удалить каплю коснувшись края сетки куском фильтровальной бумаги.
5. Дать препаратам высохнуть и аккуратно перенести сетки в специальные контейнеры. Пока препараты сохнут их необходимо аккуратно накрыть крышкой от чашки Петри, чтобы избежать попадания пылинок на сетки. Препарат можно просматривать в электронном микроскопе через 20 минут после окраски.
Практическая работа № 2. Заключение клеток культуры HeLa эпоксидную смолу
Эпон 812.
Цель работы: овладение методом подготовки препарата для электронной микроскопии.
Объект исследования: клетки культуры HeLa.
Приборы и реактивы: глутаровый альдегид 25% (Electron microscopy grade),
фосфатный буфер, 50, 70, 90 %водные растворы этилового спирта, 100% спирт, ацетон, эпоксидная смола, заливочные плашки, термостаты на 37ºС и 60ºС, дистилированная вода.

90
Меры безопасности при проведении работы: большинство веществ, используемых при проведении этих процедур, являются ядовитыми, поэтому работать необходимо в халате и в перчатках и выполнять все манипуляции с образцами в вытяжном шкафу.
Катализатор DMP-30, который используется при приготовлении Эпона, обладает канцерогенным действием. Поэтому всю испачканную Эпоном посуду, фильтровальную бумагу, перчатки, кончики пипеток и т.д. необходимо поместить в термостат на +60ºС на несколько дней. За это время Эпон полностью заполимеризуется и станет неопасен.
Последовательность экспериментальных операций:
1. Приготовить 2,5% раствор глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере
Зеренсена (pH 7,4).
2. Удалить пипеткой из чашки Петри культуральную среду, клетки быстро промыть буфером Зеренсена, после чего в чашку Петри налить фиксатор. Время фиксации при комнатной температуре 1.5 часа.
3. Отмыть фиксатор в трех сменах (по 5 минут) фосфатного буфера.
4. Развести буфером Зеренсена исходный раствор четырехокиси осмия (2-4%) до конечной концентрации 1% непосредственно перед использованием. Постфиксацию проводить на каплях (клетками вниз!) во влажной камере на поверхности парафильма, в темноте, при комнатной температуре в течение 1 часа. Важно!
Тетраоксид осмия летуч и сильно ядовит!
5. Отмыть стекла с клетками в чашках Петри в трех сменах дистилированной воды по
5 минут.
6. Проинкубировать стекла с клетками в 50% водном растворе этилового спирта (2 смены по 5 минут). В ходе этих двух промывок из клеток вымывается непрореагировавшая четырехокись осмия, при этом раствор спирта может почернеть.
Необходимо добиться, чтобы последний спиртовой раствор был прозрачным, поэтому иногда число смен спирта необходимо увеличить.
7. Проинкубировать стекла с клетками в 70% водном растворе этилового спирта (2 смены по 10 минут).
8. Оставить клетки на ночь в 2% растворе уранил ацетата на 70 % спирта при температуре +4ºС. Если предполагается контрастировать препараты уранил

91
ацетататом непосредственно на срезах, то эту обработку нужно пропустить и сразу после пункта 7 продолжить обезвоживание препарата в 90% спирте.
9. Проинкубировать стекла с клетками в 90% водном растворе этилового спирта (2 смены по 15 минут).
10. Проинкубировать стекла с клетками в 100 % этиловом спирте (2 смены по 20 минут).
11. Перенести стекла с клетками в стеклянную или полиэтиленовую посуду, устойчивую к ацетону. Важно! Не забыть нанести маркировку препаратов на
новую посуду, чтобы не перепутать образцы!
12. Проинкубировать стекла с клетками в 100 % ацетоне (3 смены по 20 минут).
Следить, чтобы при инкубации и смене ацетона поверхность стекол с клетками не подсыхала.
13. Проинкубировать стекла с клетками в смеси 100 % ацетона и Эпона (2 к 1, 1 час).
14. Проинкубировать стекла с клетками в смеси 100 % ацетона и Эпона (1 к 2, 1 час) с открытыми пробками под тягой.
15. Проинкубировать стекла с клетками в Эпоне (на ночь) с открытыми пробками под тягой.
16. Перенести стекла с клетками в заливочные плашки, залить новой сменой Эпона, оставить на 24 часа в термостате при 37ºС.
17. Провести полимеризацию Эпона в термостате при – 48 ч при 60ºС.
18. Отделить стекла от заливок. Для этого очистить поверхность стекол от Эпона, поместить заливки в горячую воду и затем быстро их перенести в емкость с жидким азотом. При необходимости повторить эту операцию несколько раз. Под микроскопом найти клетки и заточить на них пирамидку. Препарат готов к изготовлению на ультрамикротоме полутонких или ультратонких срезов.

92

перейти в каталог файлов