Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу Цитогенетика

57
поверхности клетки, цитоскелета, онкогенов и генов-регуляторов апоптоза, клеточного ядра и т.д. Кроме того получены антитела, которые взаимодействуют с модифицированными нуклеотидами, например с бромдезоксиуридином, что позволяет выявлять сайты включения этого нуклеотида в ядра клеток для картирования паттернов репликации ДНК.
Структура иммуноглобулинов.
Антитела (иммуноглобулины) продуцируются клетками иммунной системы, прежде всего B-лимфоцитами, и являются одним из компонентов защиты организма от инфекционных агентов, токсинов и других чужеродных веществ.
Иммуноглобулины располагаются в виде мембранных белков на поверхности лимфоцитов и присутствуют в свободном виде в плазме крови. Проникший в организм чужеродный антиген узнается клетками иммунной системы, что вызывает пролиферацию лимфоцитов, которые ответственны за продукцию антител, взаимодействующих с этим антигеном. Антитела взаимодействуют с определенным участком молекулы антигена, которая называется эпитопом. С одним и тем же антигеном могут специфически связываться несколько различных антител, взаимодействующих с разными эпитопами.
Иммуноглобулины (Ig) являются семейством Y-образных (по пространственной структуре) гликопротеинов, у которых обе вершины («буквы Y») могут связывать антиген. Молекула наиболее важного из них – иммуноглобулина класса G (IgG) - представляет собой крупный тетрамер (150 кДа) из двух идентичных тяжелых цепей
(Н-цепей) и двух идентичных легких цепей (L-цепей) (Рис. 1). В обеих H-цепях также имеется ковалентно связанный олигосахарид. Иммуноглобулины расщепляются протеиназой папаином на два F
ab
-фрагмента и один F
c
-фрагмент (Рис. 1). Оба F
ab
- фрагмента (от англ. antigen binding fragment — антиген-связывающий фрагмент) состоят соответственно из одной целой L-цепи и N-концевой части H-цепи.
Изолированные F
ab
-фрагменты сохраняют способность связывать антиген, что позволяет использовать их для иммуноцитохимического анализа.
При обработке антител пепсином происходит расщепление молекулы иммуноглобулина на фрагменты F(ab´)
2
и pFc' (Рис. 1). Использование для иммуноцитохимического окрашивания меченых флуорохромами F(ab´)
2
фрагментов не приводит к существенному ослаблению сигнала, так как в обоих случаях – и с

одной молекулой целого иммуноглобулина, и с F(ab´)
2
фрагментом – связывается несколько молекул флуорохрома.Преимущество использования F(ab´)
2
фрагментов состоит в том, что некоторые типы клеток, в частности клетки лимфатической системы, содержат на своей поверхности Fc-рецепторы, связывание с которыми целых молекул антител повышает уровень неспецифического окрашивания..
Рис. 1.Строение молекулы IgG и ее составных частей, получаемых при фрагментации
IgG папаином или пепсином и используемых при иммуноцитохимических окрасках.
Условные обозначеия: VL – вариабельная часть легкой цепи, CL – консервативная
часть легкой цепи, VH – вариабельная часть тяжелой цепи, CH1,CH2,CH3 –
консервативные части тяжелой цепи.
58

59
Предварительное удаление Fс-участков иммуноглобулинов позволяет отчасти решить эту проблему. В качестве вторых антител также используют Fab-фрагменты.
Недостаток их применения состоит в том, что в отличие от целых иммуноглобулинов и от F(ab´)
2
-фрагментов, Fab-фрагменты имеют только один антиген-связывающий участок, следовательно прочность его связывания может оказаться пониженной. Тем не менее, конъюгаты на основе Fab-фрагментов широко используют при выявлении антигенов на ультраструктурном уровне, поскольку их меньший размер, по сравнению с целыми молекулами антител, способствует лучшему проникновению внутрь клетокF
с
-Фрагмент (от англ. fragment crystallizable — способный кристаллизоваться) состоит из С-концевой половины обеих H-цепей (Рис. 1). Эта часть IgG выполняет функции связывания с клеточной поверхностью, взаимодействия с системой комплемента и участвует в переносе антител.
Моноклональные и поликлональные антитела.
Антитела получают путем иммунизации животных соответствующими антигенами. В лабораторных условиях в качестве животных для иммунизации используют мышей, морских свинок, кроликов. На специализированных предприятиях по получению антител используют более крупных животных: овец, коз, лошадей. Также возможно использовать для получения антител птиц, в частности кур: антитела после иммунизации выделяют из желтков яиц. Антигеном может служить как какая-либо клеточная фракция, так и очищенный белок или синтезированный пептид. Для характеристики антител введены понятия аффинность
(аффинитет) и авидность (авидитет). Аффинность - это параметр, описывающий взаимодействие конкретной молекулы антитела с антигенной детерминантой.
Авидность описывает силу кооперативных аффинных взаимодействий всех антител.
Авидность зависит не только от суммы аффинностей, но и от количества связывающих центров и особенностей пространственной структуры антигена, которые могут создавать стерические препятствия для образования комплекса антиген-антитело. В поликлональной сыворотке авидность многократно возрастает за счет поливалентности большинства антигенов.
Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом

60
антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению.
Иммунная система организма устроена эшелонированно – существует несколько "линий защиты" от внедрения антигенов. Это иммуноглобулины классов G, D, E, A,
M, из которых первые три могут связать по две молекулы антигена, то есть являются двувалентными; IgA четырех- или восьмивалентны, а IgM – десятивалентны. С учетом того, что антиген, используемый для иммунизации животного, содержит не одну, а несколько антигенных детерминант, можно представить, какое множество антител вырабатывается в организме на введение одного антигена. Антиген вводят животному вместе с неспецифическим стимулятором иммунного ответа –
адъювантом Фрейнда, который стимулирует пролиферацию лимфоцитов. Для повышения концентрации антител в сыворотке крови иммунизацию проводят несколько раз. Вначале в организме животного происходит образование низкоаффинных антител, и только после повторной иммунизации, в течение 1-1,5 месяцев, в процессе созревания иммунного ответа, образуются высокоаффинные антитела, высокая концентрация которых сохраняется в организме длительное время.
При таком способе антитела производят несколько клонов плазматических клеток, поэтому сыворотки и называются поликлональными.
Для очистки и стандартизации поликлональных антител используется аффинная хроматография. Сыворотка крови от иммунизированного животного пропускается через колонку с полисахаридными шариками с которыми ковалентно связан антиген.
Специфические антитела связываются антигеном, а все другие белки, в том числе антитела с низким сродством к антигену проходят через колонку не задерживаясь.
Вслед за этим, специфически связанные антитела смывают с колонки кислым или щелочным раствором: связь антигена с антителом нековалентна. Один цикл аффинной очистки позволяет повысить концентрацию специфических антител в сыворотке в 1000 раз и более. Следует отметить, что наиболее «ценные» антитела, обладающие максимальной аффинностью к антигену, смыть с колонки особенно трудно, поэтому наряду со значительным повышением специфичности, очищенные антитела могут, иногда, обладать более низкой авидностью.
Однако даже такой способ очистки не позволяет избавиться от гетерогенности антител в сыворотке. Чтобы этого добиться, необходимо получать антитела одной специфичности, реагирующие с единственной антигенной детерминантой. Такие

61
антитела называются моноклональными. Их получают методами клеточной инженерии, путем гибридизации иммунокомпетентных B-лимфоцитов и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому размножению и неограниченному числу делений (в отличие от большинства неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физико-химических свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с "чужими" антигенами.
Для иммуноцитохимического анализа используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела. Преимуществом использования моноклональных антител по сравнению с поликлональными сыворотками является более высокая специфичность к антигену. В то же время, присутствующие в поликлональной сыворотке, антитела к различным эпитопам антигена позволяют использовать более широкий диапазон методов фиксации, что принципиально важно для сохранения структур клетки, так как нарушение структуры одного из эпитопов не обязательно приводит к изменению остальных. Кроме того, при использовании поликлональных сывороток за счет присутствия антител к различным эпитопам чувствительность метода выявления исследуемого антигена выше, чем при использовании моноклональных антител.
Основные этапы иммуноцитохимии.
Пермеабилизация.
Для того, чтобы молекулы антител могли связаться с внутриклеточными антигенами, мембрана клеток должна быть частично разрушена или перфорирована - должна быть проведена пермеабилизация клеток.
В качестве пермеабилизирующих агентов используют различные неионные детергенты (NP-40, Nonidet P-40, Triton X-100, Brij-35, Tween-20, дигитонин). Два близких по химическому составу детергента, которые часто принимают за один – NP-
40 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) и Nonidet P-40 (octyl phenoxypoly ethoxylethanol)
– существенно повреждают клеточную мембрану и используются в концентрациях от
0,1 до 1 процента. Nonidet P-40 химически идентичен детергенту, выпускаемому под широко известной торговой маркой Triton X-100. Детергенты Brij-35
(polyoxyethylenglycol dodecyl ether), Tween-20 (Poly(oxyethylene)-sorbitane-

62
monolaurate) и дигитонин (и другие сапонины) считаются более "мягкими", то есть меньше повреждающими клеточные мембраны. В некоторых случаях, когда необходимо увеличить доступность антигена, клетки обрабатывают детергентом либо перед фиксацией, либо одновременно с ней. Иногда детергент (чаще всего, Tween-20) в низкой концентрации (0,05-0,5 %) добавляют в буфер, который используется для разведения антител, поскольку считается, что это частично блокирует их неспецифическое связывание с клеточными структурами.
Фиксация.
В иммуноцитохимиибольшое значение имеет правильный выбор фиксатора. С одной стороны, фиксатор должен быстро и эффективно остановить все внутриклеточные процессы и стабилизировать клеточные компоненты таким образом, чтобы они не смещались при последующих обработках относительно своего положения в живой клетке. С другой стороны, фиксатор не должен существенно изменять пространственную организацию белков, не должен приводить к маскировке или к повреждению антигенных детерминант, к которым получены антитела.
При работе с культивируемыми клетками животных самыми популярными фиксаторами являются глутаровый альдегид, формальдегид и метанол.
Применительно к конкретной задаче эти фиксаторы могут также использовать последовательно в различных комбинациях.
Фиксация глутаровым альдегидом хорошо сохраняет структуру клеток, но за счет эффекта сшивания белков делает невозможным доступ антител ко многим антигенным детерминантам. Поэтому, за редкими исключениями, фиксацию глутаровым альдегидом применяют только после предварительной пермеабилизации клеток. Кроме того, фиксация глутаровым альдегидом приводит к появлению неспецифического связывания антител со свободными альдегидными группами. Для предотвращения неспецифического связывания перед иммуноцитохимичекой окраской клетки обрабатывают раствором боргидрида натрия, глицина или хлорида аммония.
В отличие от фиксации клеток для морфологического анализа,

63
формальдегидный фиксатор для иммуноцитохимического окрашивания рекомендуется готовить из порошка параформальдегида непосредственно перед использованием. Для многих антигенов такая фиксация дает удовлетворительные результаты, но требует проведения пермеабилизации до или сразу после фиксации.
Однако формальдегидная фиксация может нарушать структуру наиболее чувствительных антигенов.
Фиксация холодным (-20
о
С) метанолом или ацетоном сильно повреждает мембранные клеточные структуры. Вместе с тем, частичное повреждение клеточной мембраны позволяет проводить иммуноцитохимическую окраску клеток без дополнительной пермеабилизации. Это метод фиксации позволяет сохранить наилучшим образом структуру белков-антигенов за счет того, что при фиксации метанолом не образуются внутрибелковые и межбелковые сшивки.
Для некоторых антигенов лучшие результаты получаются при использовании смесей метанола и низких концентраций формальдегида, как при комнатной температуре, так и при -20
о
С.
При исследовании поверхностных антигенов в ряде случаев для иммуноцитохимического анализа можно использовать нефиксировенные клетки.
Обычно реакция проводится при пониженной температуре, чтобы исключить фагоцитирование клетками антител, связывающихся с их поверхностью.
В любом случае, при исследовании новых белков одновременно используют несколько различных протоколов фиксации, чтобы исключить ошибочную интерпретацию полученных результатов.
Блокирование сайтов неспецифического связывания.
Хотя константа связывания антител с соответствующим антигеном существенно превосходит константу связывания этих антител c другими клеточными компонентами, в ряде случаев можно специальными обработками повысить специфичность иммуноцитохимической окраски. Для этого используют вещества, которые непрочно и неспецифично связываются с клеточными белками. Наиболее распостраненными веществами, которые для этого используют, являются: 0,1-10% раствор бычьего сывороточного альбумина, 1-5 % раствор обезжиренного молока

64
(действующим агентом в этом случае является белок молока - казеин), яичный белок - овальбумин, неимунная сыворотка того животного, в котором были получены вторые антитела. Эти белки временно блокируют как специфический антиген, так и все другие. В процессе инкубации происходит конкуренция за места связывания между этими веществами и специфическими антителами. Так как антитела связываются с антигеном прочнее, то постепенно на специфических местах связывания происходит замещение молекул блокатора антителами, а все неспецифические места связывания примерно равновероятно связываются с антителами и с блокирующими белками.
Поскольку концентрация блокирующих белков в растворе многократно выше, то практически все места потенциально неспецифического связывания антител оказываются закрытыми блокирующими белками. Те же немногочисленные места, где в процессе инкубации остались неспецифически связанные антитела, освобождаются ими при последующих отмывках.
Инкубация с антителами.
Для иммуноцитохимического окрашивания образцов концентрация антител должна составлять 0.5-10 мкг/мл. Обычно коммерческие антитела используются в разведении 1:100. В первом эксперименте, как правило, производится раститровка антител в концентрациях от 1:50 до 1:1000. Сыворотку или антитела обычно разводят буфером PBS (pH 7,4) с добавлением BSA (0,1-1%). Иногда в состав буфера также входит детергент Tween-20 (0.05-0,1 %) или Triton X-100 (0.1%). Время инкубации с антителами, как правило, составляет 1-2 часа при комнатной температуре, или 10-24 часа при +4°С, или 20-60 мин при +37°С. Условия инкубации образца с коммерческими антителами (буферный раствор для разведения, разведение исходного препарата антител, время инкубации и температурный режим) обычно указаны в прилагаемой инструкции к антителам.
Несвязавшиеся антитела отмывают тем же буфером, в котором были разведены антитела. Используют от трех до шести смен буфера, инкубируют клетки в каждой смене по 5-10 минут.
Необходимо помнить, что меченые антитела обычно можно использовать только в течение нескольких месяцев (иногда до 2 лет) при условии хранения их в холодильнике (+4°С), желательно в присутствие 0,1 % азида натрия для

65
предотвращения бактериального заражения. Если антитела предполагается использовать в течение более длительного времени, то их разводят в соотношении 1:1 в глицерине, разделяют на аликвоты, замораживают и хранят при -80°С или при -
20°С. Каждая аликвота после первого использования вторично не замораживается и хранится при +4°С. При длительном хранении связь флуорохрома (или коллоидного золота, используемого для электронномикроскопического исследования локализации антигена) с антителом может разрушаться, часть молекул флуорохрома отделяется от антител. При использовании такого раствора отделившийся флуорохром неспецифически связывается с различными клеточными белками. Для частичного предотвращения этого эффекта раствор длительно хранившихся меченых антител рекомендуется перед использованием отцентрифугировать (13000 g, 3 мин).
Двойное иммуноцитохимическое окрашивание.
Существуют экспериментальные задачи, для решения которых в образце нужно выявить два различных антигена. В этом случае для избежания перекрестных реакций
(кросс-реакций) первые антитела к каждому из антигенов должны быть получены в животных разных видов. Вторые антитела связывают с разными флуорохромами, которые должны иметь непересекающиеся спектры возбуждения и испускания флуоресценции. Инкубацию можно проводить в смеси двух первых, а затем в смеси двух вторых антител. Если же концентрации двух антигенов сильно различаются, окрашивание ведут каждым антителом отдельно, так как антитела, связавшиеся с антигеном, количество которого в клетке больше, могут помешать взаимодействию других антител со вторым антигеном. Поэтому сначала проводят окрашивание первыми антителами к антигену, количество которого меньше, а затем первыми антителами ко второму антигену. В такой же последовательности обрабатывают клетки и вторыми антителами.
Контрольные препараты.
Во избежание неверной интерпретации результатов иммуноцитохимического окрашивания необходимо предварительно сделать несколько контрольных препаратов. Во-первых, нужно убедиться, что вторые антитела нормально работают с известными антигенами при данной фиксации и на данном типе клеток и подобрать оптимальную концентрацию вторых антител. Если это возможно, необходимо

66
проверить первые антитела в тех условиях, когда локализация антигена известена.
Это можно сделать и непосредственно в процессе экспериментального окрашивания.
Например, когда известно, где антиген выявляется в митотических клетках, но стоит задача изучить его локализацию на различных стадиях клеточного цикла в интерфазе.
Такие эксперименты получили название положительных контролей. Вместе с тем, в ходе иммуноцитохимического исследования необходимо ставить и так называемые отрицательные контроли. Для этого часть препаратов вместо первых антител инкубируется с буферным раствором. Естественно, после обработки связанными с флуорохромом вторыми антителами окраска в таких препаратах должна отсутствовать.
Особенно важны контроли при проведении двойного иммуноцитохимического окрашивания. В этом случае следует параллельно изготовить препараты, окрашенные отдельно на каждый из исследуемых антигенов.
Это особенно важно, если антигены в клетке располагаются очень близко (например, являются белками одного функционального комплекса), когда возможно конкурентное связывание антител.
2. Экспериментальная часть.
Иммуноцитохимические реакции очень чувствительны к изменениям концентрации растворов антител. Поэтому все инкубации должны проводиться в условиях 100% влажности, чтобы исключить подсыхание инкубационных растворов.
С другой стороны, необходимо проводить реакции на химически инертной и, желательно, несмачиваемой водой поверхности.
Приведенным условиям соответствует влажная камера, нижняя поверхность которой покрыта пленкой парафильм (Parafilm). Наиболее удобными в использовании являются чашки Петри квадратной формы, но при их отсутствии можно использовать и стандартные круглые. Соответствующий форме и размерам чашки кусок парафильма отрезается и укладывается на ее дно так, чтобы защитная бумага оказалась сверху. Бумага аккуратно отделяется и удаляется, а парафильм фиксируется на поверхности чашки точечными касаниями обратной стороной пинцета. При необходимости можно выровнить поверхность парафильма «растягивающими» касаниями пинцета. Если в ходе подготовки к окрашиванию произошло случайное касание средней части подготовленного парафильма рукой, перчаткой или пинцетом, то лист парафильма

67
необходимо заменить на новый. Для поддержания постоянной влажности по краям чашки укладывают полоски фильтровальной бумаги, смоченные дистилированной водой.
Объем капель блокирующего раствора и антител зависит от размера стекла с клетками. Для стекла диаметром 13 мм достаточно 30 мкл раствора антител или 50 мкл блокирующего раствора. Необходимо помнить, что концентрация и общее количество необходимых антител зависят и от количества клеток на стеклах. Если на стеклах имеется плотный монослой клеток, то общее количество необходимых для проведения окраски антител может вырасти в несколько раз по сравнению с окраской стекол, на которых расположены одиночные клетки или небольшие клеточные островки. Как уже указывалось, в предварительных экспериментах тестируется несколько концентраций антител в диапазоне от 1:50 до 1:1000. На практикуме для окраски будет предложена одна концентрация антител, которая была эмпирически подобрана для конкретного исследуемого антигена по результатам предварительных окрасок именно для тех клеток, которые используются для эксперимента.
При переносе стекла с клетками из раствора, блокирующего места неспецифического связывания антител (3% BSA на PBS), их не следует отмывать
(хотя в некоторых протоколах такая процедура предусмотрена). Дело в том, что постепенное замещение специфическими антителами мест связывания BSA уже в растворе первых антител (где концентрация BSA ниже, чем в блокирующем растворе), более предпочтительно для получения специфичнской окраски, чем предварительное освобождение части мест неспецифического связывания антител в процессе даже короткой отмывки.
Концентрация BSA в блокирующем растворе и в буфере для разведения АТ несколько отличается в различных протоколах. В предлагаемой практической задаче эти концентрации составляют 3% и 1 % соответственно. Снижение концентрации
BSA до 1 % в блокирующем растворе и до 0,1 % в буфере для разведения антител и отмывок представляется нежелательным, так как оно продиктовано только экономией реактивов и может отрицательно повлиять на качество окраски. Оба эти буфера после полного растворения BSA, если есть такая возможность, желательно профильтровать через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм для удаления возможных загрязнений.

68
Добавление 0,05% Tween-20 в буфер для разведения антител и отмывок желательно, но не обязательно. Если буфер был предварительно профильтрован, можно также исключить и центрифугирование растворов первых антител. Что касается центрифугирования раствора вторых антител, то его необходимо производить, если стоковый раствор хранился в холодильнике более 2 меcяцев.
Дополнительное окрашивание клеток ДНК-связывающим красителем DAPI можно осуществить на трех различных этапах окраски. А первом случае краситель добавляется в раствор вторых антител, во втором случае окрашивание производится в одном из растворов для отмывки после окраски вторыми антителами. Но наиболее удобным представляется способ, при котором DAPI (1 мкг/мл) добавляют непосредственно в среду заключения Mowiol (некоторые среды для заключения препаратов уже производятся с добавлением DAPI). В этом случае, помимо прочего, не происходит постепенной диффузии красителя и окраска ДНК остается неизменной в течение многих месяцев.
После просмотра препаратов их необходимо поместить в защищенную от света коробку и хранить в холодильнике. В зависимости от флуорохрома препараты остаются пригодными для повторного просмотра от нескольких месяцев до года.
Практическая работа: выявление ламинов А/С в клетках культуры HeLa.
Цель работы: овладение методами иммуноцитохимического окрашивания.
Объект исследования: клетки культуры HeLa.
Приборы и реактивы: буфер PBS (pH 7,4), BSA, клетки культуры ткани HeLa на покровных стеклах, свежеприготовленный раствор параформальдегида (3,7%), чашки
Петри 100 мм и 40 мм, электронномикроскопические пинцеты, детергенты Triton X-
100 и Tween 20, моноклональные мышиные антитела специфичные к ламинам (клон
Jol 2), козьи антимышиные антитела связанные с флуорохромом FITC, Mowiol, DAPI,
DABCO, световой микроскоп с объективами x40, x63, x100, оборудованный для наблюдения методами эпифлуоресценции и фазового контраста.
Последовательность экспериментальных операций:

69 1) Клетки культуры HeLa, выращенные на покровных стеклах, 5 секунд промыть в теплом (37°C) буфере PBS и перенести в раствор формальдегида (3,7%).
Продолжительность фиксации - 10 минут при комнатной температуре.
2) Клетки промыть в PBS 2 раза по 5 минут и провести пермеабилизацию в 0,5% растворе Triton X-100 на PBS в течение 5 минут при комнатной температуре.
3) Отмыть от детергента в трех сменах PBS по 5 минут в каждой.
4) Проинкубировать в 3 % растворе BSA на PBS в течение 30 минут при комнатной температуре на каплях (клетками вниз!) во влажной камере в 100 мм чашках Петри.
5) Моноклональные мышиные антитела, специфичные к ламинам А/С (клон Jol 2), развести в буфере для инкубации (1% BSA, 0,05% Tween-20 на PBS, pH 7,4) в концентрации 1:100.
6) Пинцетом перенести стекла с клетками с капель блокирующего раствора (PBS с 3
% BSA) на капли первых антител (клетками вниз!) и проинкубировать во влажной камере 1 час при комнатной температуре.
7) Стекла из влажной камеры перенести (клетками вверх!) в 40 мм чашки Петри с 3 мл буфера для отмывки (1% BSA, 0.05% Tween-20 на PBS). Отмыть в трех сменах буфера по 10 минут в каждой.
8) Вторые, связанные с флуорохромом козьи антимышиные антитела, развести в буфере для инкубации (1% BSA, 0,05% Tween-20 на PBS, pH 7,4) в концентрации
1:100.
9) Пинцетом перенести стекла с клетками из чашек Петри на капли вторых антител
(клетками вниз!) и проинкубировать во влажной камере 1 час при комнатной температуре в защищенном от света месте (например, закрыв чашку фольгой).
10) Стекла из влажной камеры перенести пинцетом (клетками вверх!) в 40 мм чашки
Петри с буфером для отмывки (1% BSA, 0.05% Tween-20 на PBS), отмыть 10 минут.
Далее отмыть 2 раза по 10 минут в чистом PBS.
11) Стекла (клетками вверх!), перенести пинцетом на фильтровальную бумагу, далее удалить излишки PBS касанием краем (!) стекла фильтровальной бумаги и положить

70
стекла (клетками вниз!) на каплю (10 мкл) среды заключения (Mowiol, DAPI 1 мкг/мл, DABCO 1мг/мл). Приготовленный препарат подписать, высушить в течение
2-3 часов при комнатной температуре (в темном месте) и хранить в холодильнике при температуре +4
о
C.
12) Препарат проанализировать, используя флуоресцентный микроскоп, сначала с использованием сухого объектива (х20 или х40), затем с использованием иммерсионного объектива (х63 или х100).
Данные о динамике ламинов в митотическом цикле клеток HeLa, зафиксированных in situ, представлены на Рис. 2. В интерфазных клетках антитела к ламинам А/С окрашивают, преимущественно, периферию ядер, а также слабо окрашивают кариоплазму. В профазе, по мере разрушения ядерной оболочки, ламины
А/С мигрируют в цитоплазму. В прометафазных, метафазных и анафазных клетках белки имеют строго цитоплазматическую локализацию. В телофазе ламины А/С преимущественно выявляются по периферии двух групп хромосом, а также в кариоплазме формирующихся дочерних ядер, при этом в цитоплазме на этой стадии также сохраняется слабое и гомогенное мечение антителами к ламинам А/С.

Рис. 2.Иммуноцитохимическая окраска на ламины А/С (левый ряд) клеток
HeLa на различных стадиях митотического деления.. В правом ряду показана
окраска ДНК в тех же клетках красителем DAPI.
71

72

перейти в каталог файлов