Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу Цитогенетика

клеток. Внедрение метода клеточных культур стало решающим событием в развитии метода прижизненных наблюдений (Рис. 1в). а
б в
Рис. 1. Прижизненное наблюдение различных биологических объектов: а)
амеба; б) сперматозоид на поверхности яйцеклетки; в) клетки культуры
ткани.
В Главе 2 подробно изложены условия культивирования клеток in vitro.
Понятно, что для цитофизиологических исследований удобнее использовать перевивные клеточные культуры. Чаще всего живые нативные клетки наблюдают с помощью метода фазового контраста (Рис. 2а), либо интерференционного контраста
(Рис. 2б), а живые клетки с включенной флуоресцентной меткой наблюдают с помощью флуоресцентного микроскопа (Рис. 2в). а
в б
Рис. 2. Различные методы наблюдения живых клеток: а) фазовый
контраст; б) дифференциальный интерференционный контраст (DIC); в)
дифференциальный интерференционный контраст, совмещенный с
наблюдением флуоресценции.
34

35
Изображения клеток регистрируют с помощью фото- или видеокамеры.
Анализ изображений проводят в реальном времени или по окончании эксперимента.
Особенности условий культивирования клеток при прижизненных наблюдениях.
В целом, условия культивирования клеток в прижизненных исследованиях сходны с условиями их культивирования в термостате, но имеются и специфические особенности, связанные с тем, что клетки периодически необходимо фотографировать. Можно отметить несколько принципиальных условий, соблюдение которых необходимо для прижизненных наблюдений: поддержание постоянной оптимальной для клеток данного типа температуры, поддержание газового состава атмосферы, поддержание оптимальной кислотности и осмотичности среды культивирования, предохранение среды культивирования от высыхания, сохранение стерильности, защита клеток от переосвещения и вибрации. Далее будут последовательно рассмотрены технические приспособления, позволяющие культивировать клетки и осуществлять прижизненные наблюдения за ними.
Поддержание постоянной температуры.
Большинство клеток теплокровных животных требуют поддержания температуры около 37
о
С. Длительное снижение температуры на несколько градусов приводит к нарушениям митотического деления и, в конечном счете, к гибели клеток.
Нагревание клеток выше 39
о
С приводит к тепловому шоку. Клетки холоднокровных животных значительно более устойчивы к охлаждению - например, митозы в них могут протекать при 9
о
С. Однако нагревание таких клеток выше 30
о
С приводит к остановке деления и гибели клеток.
При культивировании клеток в термостате постоянная температура за счет термоэлементов поддерживается во всем его объеме. Однако при переносе клеток на столик микроскопа достижение равномерного нагрева камеры с клетками существенно затрудняется необходимостью производить экспериментальные манипуляции.
Одним из решений является использование специальных воздушных фенов
(Рис. 3), оборудованных термопарой, осуществляющей обратную связь между температурой нагрева воздуха и температурой столика микроскопа. Термопара может

быть закреплена непосредственно на выходном отверстии фена или на столике микроскопа. В любом случае, до того как экспериментальные клетки окажутся на столике микроскопа, расстояние до фена и уровень нагрева воздуха должны быть тщательно откалиброваны.
Рис. 3. Современный инвертированный световой микроскоп, оборудованный
специальным
воздушным
феном
для
поддержания
постоянной
температуры на столике.
Другим вариантом контроля температуры и поддержания ее на нужном уровне является использование термостатируемых столиков микроскопа. Поскольку наблюдение клеток на больших увеличениях осуществляется с помощью иммерсионных объективов, контакт объектива со стеклом приводит с существенному оттоку тепла именно вблизи клеткок, расположенных в зоне наблюдения. Поэтому сами объективы часто снабжают дополнительными термоэлементами (Рис. 4).
36

Рис. 4. Различные типы термоэлементов для поддержания и контроля
температуры объективов светового микроскопа.
Микроскопы, предназначенные для длительных прижизненных наблюдений за клетками, могут быть оборудованы специальным прозрачным кожухом, внутри которого поддерживается как постоянная температура, так и необходимая влажность и газовый состав атмосферы (Рис. 5а).
Рис. 5. Современный микроскопический комплекс для прижизненных
наблюдений. а) общий вид комплекса, в состав которого входит
микроскоп, антивибрациооный оптический стол и защитный кожух с
системой подачи газа; б) и в) пневматические антивибрационные
прокладки различной конструкции.
а в
б
37

Поддержание стерильности.
Принципиальное значение при прижизненных исследованиях имеет поддержание стерильности среды культивирования клеток. Клетки можно наблюдать, как непосредственно в чашках Петри или специальных многолуночных «плашках»
(Рис. 6 а, б), в которых они культивировались в термостате, так и в специальных камерах для прижизненных исследований. Для получения высококачественного изображения клеток в дне чашки Петри делается окно, закрытое тонким покровным стеклом (Рис. 6в).
38
а в
б
Рис. 6. Различные культуральные чашки, пригодные для простейших
прижизненных наблюдений: а) чашка Петри; б) шестилуночная плашка; в)
чашка Петри со стеклянным «окном» на дне.
При таком методе наблюдения используется инвертированный микроскоп, в котором объектив располагается под объектом. Большое распостранение получили также специально сконструированные для прижизненных наблюдений многоразовые перфузионные камеры (Рис. 7).

Рис. 7. Специальные многоразовые перфузионные камеры для
прижизненных наблюдений
Однако, в последнее время на смену многоразовым камерам пришли одноразовые камеры различной конструкции (Рис. 8).
Рис. 8. Специальные одноразовые камеры для прижизненных наблюдений
39

Сборка камер осуществляется в стерильных условиях, в дальнейшем в закрытом виде камеры позволяют сохранять стерильность среды культивирования длительное время. Для контроля pH используют среду с добавлением красителя фенолового красного, который изменяет цвет на желтый при закислении среды и приобретает фиолетовый оттенок, если среда защелачивается.
Нарушение стерильности при наблюдении клеток в ходе прижизненных исследований приводит к существенному изменению состава и состояния среды культивирования. Иногда на ранних стадиях «пророста» (термин, используемый для обозначения ситуации, когда в среде начинает расти что-либо еще, кроме наблюдаемых клеток) бактерии, дрожжи или гифы грибов можно наблюдать в микроскоп в то время, когда цвет среды еще остается нормальным (Рис. 9).
Полученные в условиях нарушения стерильности экспериментальные результаты должны быть исключены из массива данных, используемых для дальнейшего анализа. а
в б
Рис. 9. Различные типы «проростов»: а) бактериальный; б) дрожжевой; в)
грибковый.
Нарушения нормальной жизнедеятельности клеток можно наблюдать по характерным морфологическим признакам. В частности, наличие большого количества многоядерных клеток (Рис. 10 а) свидетельствует о дефектах митоза или цитокинеза, образование внутри клетки многочисленных вакуолей может быть результатом нарушения внутриклеточного транспорта (Рис. 10б), формирование по краю клетки небольших ламелл (blebbing) и «вскипание» цитоплазмы свидетельствуют о начале некроза (Рис. 10 в, г).
40

в
б г а
Рис. 10. Морфологические особенности, характеризующие нарушения
нормальной жизнедеятельности клеток: а) многоядерные клетки; б)
вакуоли в цитоплазме клеток; в) образование на краю клетки ламелл; г)
«вскипание» цитоплазмы.
2. Экспериментальная часть.
Практическая работа: прижизненные наблюдения в фазово-контрастный микроскоп митотического деления и перехода в интерфазу в клетках линии XL2.
Цель работы: овладение навыками прижизненного наблюдения клеток.
Объект исследования: клетки линии XL2 (эпителиоидная перевивная линия, полученная из головастиков шпорцевой лягушки Xenopus laevis).
Приборы и реактивы: микроскоп инвертированный, оснащенный оптической системой для наблюдения клеток методом фазового констаста; камера для прижизненных исследований, культуральная среда L15, эмбриональная сыворотка, антибиотик-антимикотик, стерильная пластиковая посуда для культивирования клеток, стерильные пипетки, спирт этиловый.
Последовательность экспериментальных операций:
1) В стерильных условиях смонтировать камеру для прижизненных иследований.
2) Поместить камеру в пенопластовую коробку для переноски (лучше накануне вечером поставить в открытом виде эту коробку в термостат).
3) Включить микроскоп и поместить камеру с клетками на его предметный столик.
41

42 4) Сфокусировать микроскоп и найти клетку в профазе. В этой клетке хромосомы должны быть уже конденсированы, но при этом должна быть четко видна ядерная мембрана.
5) Наблюдать прохождение этой клеткой всех последующих стадий деления, включая переход в постмитотическую интерфазу, с обязательной регистрацией изображений
(см. описание ниже).
Описание митоза в клетках XL2 (обязательные наблюдения, которые
необходимо сделать в ходе выполнения задачи).
На рисунке 11 показаны последовательные фотографии клетки линии XL2 шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) в митозе и в процессе перехода от митоза к интерфазе. Точкой отсчета временной шкалы является момент съемки первого кадра серии (точка 0’ на рис. 11а).
На первой фотографии клетка находится в ранней профазе. Четкую границу между завершающим интерфазу G2-периодом клеточного цикла и профазой провести трудно, однако принято считать, что с началом профазы становятся хорошо заметными конденсированные хромосомы (фото 11а, ХР). Хромосомы погружены в кариоплазму, имеющую более светлый оттенок, чем окружающая ядро цитоплазма
(следует помнить, что понятия «светлый» и «темный» при наблюдении в фазовом контрасте не являются отражением реальной интенсивности окраски клеток, это лишь условные характеристики, используемые для удобства описания). На рис. 11а и 11б также хорошо видна ядерная мембрана, разделяющая кариоплазму и цитоплазму
(ЯМ). Светлые «пузыри», собранные в две группы в верхней и нижней области клетки, являются, по-видимому, жировыми каплями. По правому краю клетки видны расходящиеся то нее «нити» – это участки цитоплазмы, связанные фокальными контактами с подложкой, на которой культивируются клетки. В процессе митоза клетка постепенно изменяет свою форму от уплощенной, характерной для интерфазы, на «ошареную», подготавливаясь, таким образом, к процессу деления цитоплазмы, называемому цитокинезом.
Через 5 мин после начала наблюдения ядерная мембрана быстро исчезает и цитоплазма смешивается с периферической частью кариоплазмы (фото 11в). Профаза переходит в прометафазу, в которой конденсированные хромосомы беспорядочно разбросаны в центральной части клетки, при этом «ошаривание» клетки

43
прогрессирует (фото 11в и 11г). Постепенно положение хромосом все более упорядочивается, они собираются в экваториальной части клетки, формируя так называемую метафазную пластинку (МП) – таким образом, клетка переходит от прометафазы к метафазе (фото 11д, е, ж). По времени, граница перехода от прометафазы к метафазе не настолько четко выражена, как от профазы к прометафазе.
Обычно считается, что клетка перешла в метафазу, когда последняя хромосома встроилась в метафазную пластинку. При этом центромерные участки хромосом лежат по экватору, а плечи хромосом ориентированы в обе стороны от него. Сверху и снизу от метафазной пластинки видны участки клетки, имеющие форму, близкую к треугольной, в которых не обнаруживается гранул – это два полуверетена веретена деления (ВД), в полюсах которых расположены центросомы, состоящие из двух центриолей каждая. Хромосомы в составе метафазной пластинки постоянно перемещаются, то несколько приближаясь к полюсам веретена, то возвращаясь в метафазную пластинку. Этот процесс называется конгрессией хромосом, он является отражением динамического характера поддержания положения хромосом в составе метафазной пластинки. Метафаза в большинстве типов клеток является наиболее продолжительной стадией митоза. Несмотря на кажущуюся неизменность морфологии клетки в ходе метафазы, в ней в это время происходят многочисленные биохимические перестройки, являющие собой заверщающие стадии подготовки к образованию двух дочерних клеток. В частности, в клетке происходит корректировка сопряжения клеточного и центриолярного циклов.
В конце метафазы хромосомная пластинка еще более уплотняется (фото
11ж) и через минуту две группы хроматид, разделившись, начинают свое движение в полюсам веретена (фото 11з) – метафаза переходит в анафазу. На этой стадии различают два типа перемещений. С одной стороны, хромосомы движутся к полюсам веретена; с другой стороны, сами полюса веретена расходятся друг от друга. Первый процесс называется анафазой А, второй – анафазой Б. Анафаза Б обычно начинается спустя несколько минут после начала анафазы А. В процессе перемещения хромосом их центромерные участки движутся впереди, а плечи хромосом «отстают» (фото 11и, к). На хорошо распластанных клетках видны гомологичные хромосомы, имеющие одинаковую форму. Иногда плечи гомологичных хромосом не сразу полностью

44
разделяются, тогда в микроскоп видны фигуры, получившие название хромосомных мостов (фото 11л, ХМ).
Анафаза – самая скоротечная стадия митоза, уже через 6-8 минут движение хромосом прекращается и они располагаются в двух концах клетки в виде «розеток», анафаза переходит в телофазу (фото 11м). Одновременно или чуть раньше либо позднее начинается процесс цитокинеза (цитотомии). Если на фото 11м левый край клетки в экваториальной части клетки абсолютно прямолинеен, что уже через минуту заметно, что клеточная мембрана начинает стягиваться формирующейся перетяжкой
(фото 11н, ПТ). Одновременно с формированием перетяжки хромосомы постепенно деконденсируются и плечи отдельных хромосом перестают различаться (фото 11н, о, п). В норме перетяжка делит цитоплазму ровно пополам между дочерними клетками.
Однако иногда, особенно у хорошо распластанных и прикрепленных к субстрату клеток, случаются нарушения цитотомии, в этом случае в дополнение к двум клеткам могут образовываться отделенные от клеток участки цитоплазмы без хромосом – цитопласты (фото 11п-ц, ЦП), которые позднее обычно сливаются с одной из дочерних клеток. После того, как перетяжка разделяет цитоплазмы дочерних клеток, митоз заканчивается, и клетка переходит в G1-фазу клеточного цикла. В районе между дочерними клетками образуется структура, получившая название остаточного тельца (ОТ), которое часто видно в микроскоп на протяжении нескольких часов после завершения митоза (фото 11р-ч). Хромосомы постепенно декомпактизуются и вокруг них образуется ядерная мембрана (фото 11т, нижняя клетка, ЯМ). Сначала хромосомы теряют форму розетки и в ядре видны лишь глыбки хроматина. Позднее кариоплазма становится все более свободной от хроматина, и одновременно становится заметно формирующееся ядрышко (фото 11ч).

4’
б
5’
в
6’
г
20’
д
31’
ж
33’
и
34’
к
39’
м
40’
н
42’
о
48’
п
60’
р
62’
с
70’
т
75’
у
86’
ф
90’
х
95’
ц
115’
ч
0’
а
25’
е
32’
з
38’
л ям хр мп вд хм пт цп от ядрышко
Рис. 11. Прижизненное наблюдение клеток линии XL2 от стадии профазы
митоза до ранней G1-фазы интерфазы. Пояснения в тексте.
45

46

перейти в каталог файлов