Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу Цитогенетика

106
К недостаткам синхронизации клеток «тимидиновым блоком» можно, в первую очередь, отнести влияние его не только на репликацию ДНК, но и на биосинтез РНК. В связи с этим, не рекомендуется инкубировать клетки в среде с высоким содержанием тимидина более 16 ч, что позволяет использовать это вещество для синхронизации клеток только с относительно коротким клеточным циклом.
Афидиколин (aphidicolin) - ингибитор ДНК полимеразы- применяется для синхронизации клеток в S-фазе в концентрациях 1-10 мкг/мл, обладает относительно низкой токсичностью для клеток и хорошо отмывается. Оптимальная концентрация афидиколина может отличаться для разных клеточных культур.
Например, для клеток челове-ческой меланомы для ингибирования синтеза ДНК до уровня ниже 20 % необходимо использовать концентрацию афидиколина 10 мкг/мл.
В то время как для других клеточных линий концентрация 1-3 мкг/мл достаточна для полного подавления синтеза ДНК. Поскольку клетки, находившиеся на момент начала инкубации в S-фазе, задерживаются в продвижении по циклу, для эффективной синхронизации необходима или двойная обработка афидиколином с промежуточной отмывкой клеток в течение времени эквивалентного максимальной продолжительности S-фазы или предварительная синхронизация клеток другим методом, например, сывороточным истощением или изолейциновым голоданием.
Гидроксимочевина
(hydroxyurea)
является ингибитором рибонуклеотид- дифосфатредуктазы, при добавлении в среду культиви-рования в концентрации 0.5-
1mM вызывает задержку клеток в ранней S-фазе за счет истощения пула дезоксирибонуклеотидов.
Изолейциновое голодание (isoleucine deprivation). Этот метод, разработанный для клеток китайского хомячка CHO, впоследствии был с различной эффективностью опробован для других клеточных культур. Поскольку после переноса в полную среду культивирования клетки вступали в S-фазу примерно через
4 часа, можно заключить, что отсутствие в среде изолейцина блокирует продвижение по клеточному циклу в середине G
1
-фазы.
Ингибитор кальпаина (calpain inhibitior I = ALLN (N-acetyl-leucyl-leucyl-
norleucinal) ингибитор цистеиновых и сериновых протеаз включая кальпаин вызывает ингибирование деградации циклинов. В концентрации 40 мкг/мл он

107
задерживает XL2 клетки в метафазе на несколько часов. При этом веретено деления имеет нормальное строение.
Ловастатин (lovastatin) и его аналог мевастатин или компактин
(mevastatin=compactin) являются ингибиторами 3-гидрокси-3-метилглютарил-КоА
(HMG-CoA) редуктазы. Обработка ловастатином задерживает клетки в G
1
-фазе до точки рестрикции. Для синхронизации клеток ловастатин применяется в концентрации 5 μM, однако уже в концентрации 10 μM он может вызывать заметную индукцию апоптоза.
Метотрексат (methotrexate = MTX),аналог тимидина, блокирует тетрагидрофолатредуктазу, которая предотвращает метилирование dUMP тимидилат синтетазо. В концентрациях 0,88-5 μM метотрексат приводит к остановке клеточного цикла и накоплению клеток в G
0
/ G
1
. Необходимо отметить, что при синхронизации клеток метотрексатом используемая для их культивации среда не должна содержать тимидина.
Мимозин (mimosine) это редкая растительная аминокислота, являющаяся хелатирующим агентом и предотвращающая образование новых репликативных вилок, ингибируя рибонуклеазредуктазу и вызывая уменьшение пула dATP и dGTP.
Мимозин нарушает дезоксирибо-нуклеотидный метаболизм и воздействует, таким образом, на фазу элонгации ДНК. Он используется в концентрациях 200-600 μM для синхронизации клеток в ранней S-фазе.
Нокодазол (nocodazole)(а также два других вещества - колхицин (colchicine)
и колцемид (colcemide)вместе называемые анти-микротрубочковыми ядами) существенно повышает критическую концентрацию полимеризации тубулина в клетке, что приводит к деполимеризации микротрубочек и блоку митоза. Несмотря на то, что микротрубочки играют важную роль в интерфазных клетках, их деполимеризация не приводит к остановке, по крайней мере, большинства клеток в продвижении по клеточному циклу от G
1
к митозу. Описана только временная задержка клеток в G
2
-фазе клеточного цикла. Даже очень низкие концентрации нокодазола способны останавливать клетки в митозе, поэтому для каждой клеточной линии подбирается минимально достаточная концентрация (обычно 0.1–0.5 μg/ml).
При длительной инкубации для многих типов клеток обработка нокодазолом может

108
приводить к переходу клеток в интерфазу без анафазного расхождения хромосом, т.е. к полиплоидизации.
Стауроспорин (staurosporine) это алкалоид, который ингибирует циклин- зависимую киназу (cdk), связываясь с белком ретинобластомы. Для синхронизации клеток в G
1
-фазе стауроспорин применяется в концентрации 100 nM, но при длительном воздействии это может приводить к апоптозу.
Сывороточное истощение (serum depletion).Для нормального продвижения по клеточному циклу немалигнизированные клетки нуждаются во внешних ростовых факторах. Эти факторы, обычно, содержатся в эмбриональной сыворотке, которая добавляется в среду культивирования. Отсутствие в среде сыворотки приводит к задержке клеток в G
1
-фазе или выходу из цикла в G
0
-фазу.
Трихостатин A (trichostatin A = TSA),ингибитор деацитилаз гистонов.В концентрациях 0.1-5 μM обратимо блокирует клетки и в G
1 и в G
2
-фазе.
5-флуородеоксиуридин (5-fluorodeoxyuridine) ингибирует тимидилат синтазу и блокирует, таким образом, клетки в ранней S-фазе клеточного цикла. Для синхронизации используется в концентрации 0.05 μM.
Хёхст 768159 (Hoechst 768159 = [2-(4-hydroxytoluene-3-yl)-4,5-dihydro-4-
carboxythiazole])
ингибирует пост-трансляционные изменнения редкой аминокислоты гипузина (hypusine), в концентрации 40 μM останавливает клетки в поздней G
1
-фазе клеточного цикла.
Циклопирокс оламин (ciclopyrox olamine=CPX) является ингибитором инициации репликации ДНК и блокирует клетки на границе G
1
/ S , для синхронизации клеток используется в концентрации 10 μM.
Этопозид (etoposide = VP16)ингибитор ДНК топоизомеразы 2, являющийся широко распостраненным антираковым препаратом, вызывает задержку клеток в S- фазе клеточного цикла и блок на границе G2/M. Для синхронизации культивируемых
in vitro клеток он применялся в концентрациях от 0,7 до 10μM. Этопозид вызывает специфическую инактивацию киназной активности, связанной с циклином А (CDK2), что приводит к активации S-фазного и G2/M check-point контроля. При длительной инкубации обработка клеток этопозидом вызывает апоптоз.
Физические методы синхронизации и селективного разделения клеток.

109
Охлаждение клеток замедляет все клеточные процессы и приводит к увеличению процента клеток в G
1
-фазе и их выходу из цикла в G
0
-фазу. Однако при возвращении клеток в нормальные условия культивирования они идут по циклу несинхронно. Таким образом, охлаждение клеток можно использовать для получения популяции клеток в G
0
. Охлаждение также используется для предотвращения выхода в G
1
-фазу при накоплении митотических клеток синхронизованных другими методами.
Разделение центрифугированием (centrifugal elutriation)применяется для суспензионных клеточных культур или клеток снятых с подложки. Принцип метода состоит в том, что клетки разделяются по размеру за счет различной плавучей плотности при центрифугировании. Для этого используется специальный ротор центрифуги, оборудованный трубками для протока жидкости. Этот метод позволяет получать лишь клеточные фракции, обогащенные клетками в G
1
, S или G
2
, но не чистые фракции клеток различных фаз клеточного цикла. В комбинации с предварительной химической синхронизацией метод позволяет получать достаточно чистые фракции синхронизованных клеток.
Стряхивание (shake-off)митотических клеток достаточно эффективно для клеток существенно теряющих в митозе связь с подложкой культивирования, таких, как, например, мышиные фибробласты. Этот метод применяется после предварительной инкубации клеток в среде с антимитотическими ядами, чтобы повысить процент митозов за счет блока формирования митотического веретена (см. нокодазол). Для эпителиальных клеток метод существенно менее эффективен. Для повышения выхода митотических клеток культивирование ведется в специальных медленно (0.5 об/мин) вращающихся емкостях, которые периодически (каждые 10 мин) вращаются со скоростью 200 об/мин для стряхивания слабо прикрепленных митотических клеток. Для предотвращения выхода в G
1
-фазу накопленных митотических клеток используется их охлаждение. Для лучшего прикрепления интерфазных клеток, емкости для культивирования предварительно обрабатываются ацетатом магния.
Разделение клеток в проточном цитофлуориметре.Принцип метода заключается в автоматизированном разделении клеток, предварительно прижизненно окрашенных флуоресцентными красителями стохиометрически связывающимися с

Рис. 1. Схема синхронизации клеток линии XL2 для получения экстрактов из
популяций, обогащенных клетками различных фаз цикла. max G1 – популяция клеток
с максимальной долей клеток в G
1
- фазе клеточного цикла, max S, max G2, max M
- в S-фазе, G
2
- фазе и митозе, соответственно.
110

111
ДНК, например, Hoechst 33342. Недостатки метода аналогичны недостаткам метода разделения клеток центрифугированием - метод не позволяет разделять клетки в G
2
- фазе от митотических клеток и тетраплоидных клеток в G
1
-фазе.
2. Экспериментальная часть.
Практическая работа.Синхронизация клеток XL2 и получение фракций клеток G
1
,
S, и G
2
фаз клеточного цикла и митотических клеток.
Цель работы: освоение методов синхронизации клеток.
Практическая задача: получение и исследование фракций клеток G
1
, S, и G
2
фаз клеточного и митотических клеток.
Объект исследования: клетки линии XL2 (эпителиоидная перевивная линия, полученная из головастиков шпорцевой лягушки).
Приборы и реактивы: микроскоп, оснащенный оптической системой для наблюдения клеток методом фазового констаста и флуоресценции; культуральная среда L15, эмбриональная сыворотка, антибиотик-антимикотик, стерильная пластиковая посуда для культивирования клеток, стерильные пипетки, BrdU, антитела к BrdU, вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом, физиологический фосфотный буфер, НCl 1 M для гидролиза, афидиколин, нокодазол, ALLN, стекла предметные и покровные, спирт этиловый 70%, 3-кратный лизирующий буфер Лемли, специальный пластиковый скребок для соскабливание клеток.
Экспериментальные операции:
1) Клетки XL2, выращенные до конфлюэнтного монослоя, снять с помощью смеси трипсина и Версена, ресуспендировать в полной среде и посадить одновременно на пластиковые матрасы и покровные стекла в концентрации 600 клеток / мм
2 2) Через 3 часа, когда клетки прикрепились к стеклу, трижды отмыть среду теплым
PBS (25
o
C) и заменить ее средой без сыворотки.
3) Через 24 ч культивирования клетки перенести в полную среду с 40 мкМ афидиколина.
4) Через 30 ч афидиколин отмыть теплым (25
o
C) PBS и культивировать клетки в полной среде. Клетки на покровных стеклах фиксировать 70% этанолом одновременно с использованием матрасов для получения экстрактов и дополнительно каждый час после начала отмывки афидиколина.

112 5) Через 2 ч после отмывки афидиколина зафиксировать стекла с клетками и собрать фракцию клеток с максимальным процентом клеток в S-фазе. Сбор фракций клеток включает в себя следующие операции: удаление верхней крышки культурального матраса, полное удаление культуральной среды с помощью пипетки или водоструйного насоса, добавление 3-кратного лизирующего буфера Лемли, соскабливание клеток специальным скребком, сбор фракции клеток в эппендорф
(объемом 1.5 мл), обработка ультразвуком для разрушения ДНК, нагрев (90°С, 5 мин), заморозка и хранение при минус 20°С. Перед тем как использовать фракции для электрофореза, необходимо довести дистилированной водой конечную концентрацию буфера Лемли до 1 кратного. Желательно также предварительно рассчитать количество клеток во фракции и стандартизовать их по количеству клеток добавлением 1 кратного буфера Лемли, рекомендуемая концентрация 10 000 клеток/мкл конечного объема образца. Для определения количества клеток в матрасе, предварительно измеряют с помощью объект-микрометра диаметр поля зрения инвертированного микроскопа (объектив 20 х), далее рассчитывают площадь поля зрения, видимую в микроскоп через этот объектив, подсчитывают количество клеток в 20 полях зрения на различных участках культурального матраса, рассчитывают общее количество клеток в матрасе, умножая среднее количество клеток в поле зрения на коэффициент пересчета (площадь матраса/площадь поля зрения).
6) Для получения популяции, обогащенной митотическими клетками через 8 ч после начала отмывки афидиколина в среду культивирования добавить нокодазол в конечной концентрации 0.5 мкг/мл, и спустя 3 ч ALLN (40 мкг/мл). После инкубации клеток в среде с нокодазолом и ALLN (4 ч) отмыть их (4 х 5 мин) свежей средой и собрать фракцию обогащенную митотическими клетками.
7) Через 10 ч после отмывки афидиколина зафиксировать стекла с клетками и собрать фракцию клеток с максимальным процентом клеток в G
2
-фазе.
8) Фракцию клеток с максимальным процентом в G
1
-фазе получить инкубацией клеток в полной среде в течение 10 ч после отмывки смеси нокодазола и ALLN (см. пункт 7).
9) После иммуноцитохимической окраски АТ к BrdU (подробнее об окраске см.
Глава 8) подсчитать процент клеток в S-фазе и митотический индекс (5000 клеток на

точку). Исходя из этих данных рассчитать процентное содержание клеток различных фаз клеточного цикла в собранных фракциях.
10) Факультативно. Исследование с помощью специфических антител концентрации различных белков в клетках на различных стадиях клеточного цикла (электрофорез, перенос на нитроцеллюлозную мембрану, иммунохимическая окраска АТ).
113

114
Глава 10.
Приготовление хромосомных
препаратов и гибридизация in situ.
1. Теоретическая часть.
Анализ структуры хромосом имеет огромное значение как в различных разделах фундаментальной науки, так и при решении разнообразных прикладных задач, особенно в медицине. В кариотипе человека хромосомы относительно слабо отличаются друг от друга, тем не менее, на основании простого морфологического анализа все хромосомы могут быть разделены на несколько групп. Однако, для решения многих задач такого простого анализа недостаточно, поскольку требуется идентификация индивидуальных хромосом. Точно идентифицировать все хромосомы кариотипа позволяют методики дифференциального окрашивания. Наиболее простой метод позволяет выявлять районы конститутивного гетерохроматина – участков хромосом сохраняющих конденсированное состояние на протяжении всего клеточного цикла. Этот метод получил название C-окрашивания (C-banding).
Окрашивание хромосом для выявления гетерохроматических сегментов или С- сегментов включает в себя несколько последовательных обработок (слабой кислотой, щелочью, теплым солевым раствором) и окрашивание красителем Гимзы.
Гетерохроматин имеет более плотную структуру и разрушается в результате всех обработок меньше, чем эухроматические районы. Это, по-видимому, и является причиной более интенсивного окрашивания С-сегментов красителем Гимзы. У млекопитающих С-сегменты выявляются в основном в районах центромер, однако для многих организмов (например, растения с большими хромосомами) типичны крупные блоки гетерохроматина в плечах или в теломерных участках хромосом.
Из всех методов дифференциального окрашивания наибольшее распространение имеет метод G-окрашивания (G-banding), позволяющий выявить районы хромосом, имеющие различную структуру и биохимическую композицию. В результате окрашивания плечи хромосом выглядят так, как будто они образованы чередующимися светлыми и темными полосами, причем особенности размера и взаимной локализации этих полос позволяют достоверно идентифицировать все хромосомы кариотипа человека и выявить целый ряд хромосомных мутаций. По мере компактизации хромосом отдельные сегменты сливаются друг с другом, и поэтому в слабо конденсированных хромосомах общее число G-сегментов заметно выше, чем в сильно конденсированных. Так, например, общее количество сегментов в нормально конденсированных метафазных хромосомах человека примерно 350, в прометафазных хромосомах можно насчитать до 1000 отдельных сегментов. В избыточно конденсированных (гиперконденсированных) хромосомах четко выявить сегменты в количестве, достаточном для идентификации хромосом, становится невозможным,

115
поэтому для анализа дифференциального окрашивания хромосом, как правило, выбирают пластинки с относительно слабо конденсированными хромосомами.
Исключительное место в современных цитогенетических и клеточно- биологических исследованиях играет метод флуоресцентной гибридизации
нуклеиновых кислот (FISH, fluorescent in situ hybridization), основанный на способности комплементарных одноцепочечных фрагментов нуклеиновых кислот образовывать при определенных условиях прочные двухцепочечные гибриды. Особое место в генетических исследованиях занимает выявление при помощи гибридизации
in situ разнообразных хромосомных мутаций. Так, например, гибридизация со специфическими районами хромосом позволяет выявлять случаи анеуплоидии. Если в нормальных клетках выявляется две точки, соответствующие гомологичным хромосомам, то в случае триплоидии по данной хромосоме выявляется три точки.
Несколько сложнее схема экспериментов тогда, когда надо выявить перестройки хромосом. При этом имеет смысл выявлять только очень небольшое количество перестроек – тех, которые являются характерными для той или иной болезни. Часто перестройки хромосом могут с высокой частотой встречаться в определенном типе опухолей, что помогает в установлении диагноза и назначении схемы лечения.
Отдельный интерес представляют гибридизационные пробы, позволяющие выявить целые хромосомы (chromosome paints). Такие пробы можно получить из хромосом, разделенных либо с помощью проточного цитофлуориметра (сортера), либо с помощью методов микродиссекции, причем в последнем случае можно получить пробы и на отдельные районы хромосом. Гибридизационные пробы, выявляющие ту ли иную хромосому или ее участок, широко используют для изучения хромосом в митозе, мейозе и интерфазе, в различных сравнительных эволюционных исследованиях и для выявления транслокаций, в которые вовлечены меченные хромосомы. В частности, с помощью таких проб было продемонстрировано, что отдельные хромосомы в составе интерфазных ядер занимают ограниченные районы –
хромосомные территории. Причем, если в хромосоме располагается много транскрипционно активных генов, то хромосома будет локализоваться в центральной области ядра, и наоборот, если транскрипционно активных генов в хромосоме мало, то располагаться такая хромосома будет ближе к периферии ядра. Эти и многие другие факты, свидетельствующие о высокой пространственной упорядоченности хромосом и некоторых процессов (транскрипции, процессинга, репликации и т.п.), в настоящее время интенсивно разрабатываются в рамках концепции хромосомных территорий.
Основные этапы получения хромосомных препаратов.
Для анализа структуры хромосом любым из описанных выше методов необходимо использовать специально приготовленные хромосомные препараты.
Понятно, что при изучении хромосом в интактных митотических клетках, где

116
хромосомы собраны в компактную метафазную пластинку, различить индивидуальные хромосомы практически невозможно. Кроме того, хромосомы занимают в делящейся клетке довольно большой объем, что делает необходимым проведение 3D-реконструкций. На ранних этапах развития цитогенетики хромосомы изучали именно так, что позволило сделать большое количество важнейших открытий, но это одновременно требовало от исследователя огромного мастерства и невероятной кропотливости. Позднее были разработаны методы, позволяющие разрушить зафиксированную клетку и разбросать хромосомы по поверхности стекла.
Получаемые хромосомные препараты позволяют проводить цитогенетический анализ с использованием всего спектра современных методов клеточной биологии.
Существует довольно большое количество вариантов получения хромосомных препаратов, что в первую очередь определяется источником, из которого получен материал. Например, для получения хромосомных препаратов из растений, клетки которых окружены плотной клеточной стенкой, необходимо раздавить зафиксированную ткань под покровным стеклом (давленные препараты). Если надо получить очень качественный препарат, то растительная ткань после фиксации обрабатывается растворами ферментов, разрушающих клеточные стенки, и таким образом клетки переводятся в суспензию. Только после этого маленькая капелька суспензии накрывается покровным стеклом, производится надавливание, после чего высвобождаются отдельные хромосомы. К технике давленных препаратов приходится прибегать и при работе с политенными хромосомами из слюнных желез двукрылых насекомых. Несколько легче обстоит дело при работе с животными клетками, которые можно перевести в суспензионное состояние еще живыми. Тогда суспензию зафиксированных клеток раскатывают с небольшой высоты на поверхность стекла, при этом клетки разрушаются и хромосомы распределяются по поверхности стекла.
Стандартным источником получения хромосом человека является лимфоциты периферической крови. Обычно изолированные лимфоциты инкубируют в присутствии митогена, т.е. вещества стимулирующего выход клеток из G
0
и последующее деление клеток. Активированные таким образом лимфоциты обрабатывают митостатиком (нокодазол или колхицин), который разрушает микротрубочки и блокирует клетки в метафазе. Очевидно, что чем длиннее обработка митостатиком, тем больше хромосомным пластинок будет в препарате. Однако, как упоминалось ранее, в течение обработки митостатиком хромосомы продолжают компактизироваться и, соответственно, увеличение количества хромосомных пластинок будет сопровождаться повышением доли пластинок с избыточно конденсированными хромосомами, которые мало подходят для анализа.
Следующий важный этап подготовки хромосомных препаратов – обработка клеток гипотоническим раствором (обычно 0.075 М KCl, что по ионной силе соответствует половине обычного физиологического раствора – 0.14 М NaCl).
Гипотоническая обработка имеет несколько эффектов. В частности, во время ее

117
проведения хромосомы распределяются по всей цитоплазме, что в дальнейшем облегчит разбрасывание по поверхности стекла. Очень важным эффектом является набухание хромосом – при гипотонической обработке хромосомы набухают неравномерно, что в дальнейшем позволяет выявлять различные участки хромосом, такие как G-сегменты.
Сразу после гипотонической обработки хромосомы фиксируют в смеси метанола
1
и ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор приводит к резкой конденсации набухших хромосом, разбросанных гипотонией по цитоплазме. Кроме того, этот фиксатор вымывает значительную часть клеточных компонентов. Удаление цитоплазмы в ходе фиксации является важным этапом получения хорошего хромосомного препарата, т.к. если цитоплазма остается, то хорошо окрасить препарат, как правило, не удается. Поэтому фиксацию проводят в нескольких сменах фиксатора. После фиксации препарат раскапывают на влажные холодные предметные стекла.
2. Экспериментальная часть.
Практическая работа №1.Приготовление хромосомных препаратов из культивируемых клеток HeLa.
Цель работы: обучение методу полученияхромосомных препаратов
Объект исследования: клетки культуры HeLa
Приборы и реактивы: культуральный флакон с культивируемыми клетками; раствор нокадазола; раствор Хенкса; свежеприготовленный раствор трипсина-версена; 0.075
M раствор KCl; свежеприготовленный фиксатор (этанол-уксусная кислота в объемном соотношении 3:1; центрифужные пробирки объемом 15 мл; тщательно промытые в дистиллированной воде покровные стекла, охлажденные до +4ºС; краситель Гимзы; буфер Зеренсена (рН 7.0); заливочная смесь DePex; фазово-контрастный микроскоп, оборудованный объективами 10х и 40x.
Последовательность экспериментальных операций:
Поскольку препарат будет приготовлен из клеток, растущих на поверхности пластика, а не в суспензии, клетки, обработанные нокадазолом, необходимо перевести в суспензию. Делается это с помощью смеси трипсина и версена, сходно с тем, как клетки снимают с поверхности культурального флакона при их культивировании.
1
Хорошие результаты можно получить также и при использовании этанола.

118 1) За 1-2 часа до приготовления препаратов в среду культивирования добавляют раствор нокодазола
1
до конечной концентрации 0.1 мкг/мл (можно использовать и другие митостатики, например, колцемид или колхицин).
2) Для приготовления одного десятка хромосомных препаратов достаточно одного культурального флакона объемом 75 мл с культивируемыми клетками. После того как среда слита, клетки аккуратно промывают раствором трипсин-версена, и инкубируют во второй смене (все расворы сливают и наливают по крышке флакона, а не по его дну, где растут клетки, чтобы не смыть и не удалить метафазы, которые прикреплены к поверхности пластика слабее, чем интерфазные клетки). Когда клетки ошариваются их стряхивают с пластика.
3) Суспензию клеток в растворе трипсин-версена сливают в пробирку на 15 мл, клетки центрифугируют 5 мин при 500g, заменяют раствор версена на раствор
Хенкса (обязательно нагретый до 37ºС) и центрифугируют повторно.
Процедура замены раствора в пробирке после центрифугирования требует особого внимания. После того как удаляемый раствор вылит осадок клеток необходимо ресуспензировать в остатке жидкости, каким бы маленьким не было ее количество. Для этого пробирку закрывают, держа ее за крышку одной рукой, и несколько раз встряхивают резкими ударами пальцев второй руки по донышку.
Если клетки не ресуспензировать, то они агрегируют. Только после этого, при постоянном встряхивании пробирки, вносится следующий раствор
2 4) После центрифугирования раствор Хенкса сливают не полностью. Должен остаться небольшой объем (менее 0.5 мл) в котором осажденные клетки ресуспензируются встряхиванием. После этого добавляют, постоянно перемешивая, 10 мл 0.075 M раствор KCl. Гипотонический раствор обязательно должен быть нагрет до 37ºС. Общее время гипотонической обработки 5-15 мин
(включая центрифугирование). Во время гипотонической обработки хромосомы сначала деконденсируются, а затем постепенно конденсируются. Причем, конденсация происходит дифференцированно, сначала конденсируется материал
G-сегментов. Надо учитывать, что разные клетки имеют разную устойчивость к действию гипотонического раствора, что в первую очередь касается трансформированных клеток.
5) Гипотонический раствор сливают, и клетки ресуспензируют в его остатках.
После этого при постоянном помешивании по каплям добавляют 10 мл свежеприготовленного фиксатора (метанол-уксусная кислота в объемном соотношении 3:1). Фиксатор должен быть предварительно охлажден до -20ºС.
Фиксируют 15 мин в холодильнике на -20ºС.
1
Стоковый раствор нокодазола готовят на DMSO; наиболее удобна для последующей работы концентрация 1 мг/мл.
2
Такой схемы смены растворов следует придерживаться всегда, кроме случаев, когда необходимо сформировать плотный осадок.

119 6) Клетки центрифугируют, сливают фиксатор и добавляют новый. Процедуру повторяют минимум четыре раза (если вокруг хромосом на готовом препарате остаются остатки цитоплазмы, то количество смен фиксатора можно увеличить до шести).
7) Суспензию вновь центрифугируют, сливают фиксатор и добавляют примерно
0.20 мл нового фиксатора, чтобы получилась слегка мутная суспензия.
8) Суспензию раскапывают на покровные стекла
1
. Для получения хороших препаратов абсолютно необходимо отмыть стекла в концентрированной серной кислоте. После того как стекла вымыты, их помещают в стакан или бюкс с дистиллированной водой, который ставят в холодильник. После того, как стекла охладятся, их достают по одному из стакана, аккуратно удаляют избыток воды и быстро капают на стекло небольшое количество суспензии клеток в фиксаторе.
9) Просмотр препаратов в режиме фазового контраста, позволяет убедиться в том, что плотность клеток не слишком велика и не слишком низка. В первом случае необходимо разбавить суспензию, во втором - отцентрифугировать и ресуспензировать клетки в меньшем объеме фиксатора. Приготовленные препараты необходимо высушить в течение суток.
10) Препарат окрашивают красителем Гимзы. Для окрашивания хромосом используют 4% краситель на фосфатном буфере Зеренсена pH 7.0
(Приложение).
11) Препараты промывают в проточной воде, высушивают, промывают в толуоле или ксилоле и заключают в DePeX.
Митотические хромосомы представляют собой палочковидные структуры разной длины и примерно одинаковой толщины (рис.). В месте прикрепления микротрубочек хромосома несколько утоньшается – эту зону называют первичной
перетяжкой или центромерой. В центромерных районах располагаются кинетохоры к которым в метафазе и анафазе приклепляются микротрубочки митотического веретена. Центромера делит хромосомы на два плеча. Каждое плечо заканчивается участком, имеющим особые свойства, называемом теломерой. Разделение хромосомы на две хроматиды хорошо заметно на стадии поздней метафазы, когда хроматиды остаются связанными только в области центромеры.
Наиболее простыми характеристиками хромосом являются их длина и центромерный индекс (отношение длины короткого плеча к длине длинного плеча), характеризующий положение центромеры. Так, хромосомы с практически равными плечами называют метацентрическими хромосомами; с плечами неодинаковой длины
1
Очень часто суспензию хромосом раскапывают на предметные стекла. Это удобно только при использовании классических цитогенетических методов окрашивания хромосом. Для проведения иммуноцитохимии, гибридизации in situ и т.п. удобнее работать с покровными стеклами.

120
– субметацентрическими; если одно из плеч очень маленькое, плохо заметное, такую хромосому называют акроцентрической. Однако отличить все хромосомы, основываясь на таких простых признаках, не всегда возможно.
Практическая работа №2.Выявление продольной дифференцированности хромосом клеток культуры HeLa с помощью G-метода.
Цель работы: обучение методу дифференциальной окраски хромосом
Объект исследования: клетки культуры HeLa
Приборы и реактивы: покровные стекла с раскапанными на них хромосомными препаратами; свежеприготовленный раствор трипсина на PBS; краситель Гимзы; буфер Зеренсена (рН 7.0); заливочная смесь DePex; фазово-контрастный микроскоп, оборудованный объективами 10х, 40х и 100x.
Последовательность экспериментальных операций:
Наиболее популярной методикой для окрашивания хромосом для получения
G-сегментирования является метод окрашивания красителем Гимза после обработки трипсином. Наиболее сложным моментом в данной методике является подбор условий обработки трипсином. Рабочие качества трипсина сильно зависят как от самого трипсина, так и от чувствительности хромосом. Пользоваться можно трипсином любой фирмы, однако в каждом конкретном случае время обработки следует подбирать отдельно.
1) Препараты обрабатывают трипсином в течении примерно 30 сек, для чего на препарат наносят несколько капель свежеприготовленного раствора трипсина на фосфатно-солевом буфере (PBS). Концентрацию трипсина и время обработки подбирают эмпирически.
2) Стекла промывают в дистилляте.
3) Окрашивают красителем Гимза. Для окрашивания хромосом используют 4% краситель на фосфатном буфере Зеренсена pH 7.0.
4) Препараты промывают в проточной воде, высушивают, промывают в толуоле или ксилоле и заключают в DePeX.
5) Препараты изучают под иммерсией. Если хромосомы избыточно гидролизованы ферментом, то надо сильнее развести трипсин, если сегментирование выявляется с трудом – приготовить более концентрированный раствор.

121

перейти в каталог файлов