Учебное пособие для проведения практических занятий по курсу Цитогенетика

Глава 11.
Выявление активных ядрышковых
организаторов.
1. Теоретическая часть.
Район ядрышкового организатора – участок хромосомы, содержащий последовательности ДНК, кодирующие рибосомную РНК. Гены рибосомной РНК относятся к повторяющимся последовательностям генома. Так, у человека на диплоидную клетку приходится около 400 последовательностей. Эти гены собраны в нескольких строго определенных локусах на хромосомах: например, у человека они располагаются на коротком плече акроцентрических хромосом 13, 14, 15, 21 и 22.
Однако в норме из 10 имеющихся в диплоидной клетке человека ядрышковых организаторов активны не более 7-8. Таким образом, существует некоторый резерв рибосомальных генов, позволяющий при необходимости резко увеличить продукцию рРНК.
Рибосомная РНК является составляющей частью белок-синтезирующих органелл клеток – рибосом. Отсюда очевидно, что изменение активности продукции рибосомной РНК может служить индикатором общей транскрипционной активности клетки. Синтез рибосомной РНК происходит в течение всей интерфазы. Количество ядрышек, как правило, меньше, чем количество активных ядрышковых организаторов, что объясняется ассоциацией отдельных ядрышковых организаторов различных хромосом в интерфазном ядре (ядрышковая ассоциация).
Существуют два основных подхода к выявлению ядрышковых организаторов.
Первый способ – выявление рибосомных генов с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Приложение этого подхода к хромосомным препаратам позволяет установить общее количество ядрышковых организаторов и их локализацию. Однако большую информацию способен дать метод выявления ядрышковых белков. Многие из белков, вовлеченные в процессы синтеза или процессинге рРНК, хорошо охарактеризованы и к ним имеются антитела, что позволяет использовать для характеристики ядрышек иммуноцитохимические методы. Не меньший интерес представляет метод серебрения активных ядрышковых
организаторов, заключающийся в обработке в определенных условиях фиксированных клеток нитратом серебра. При этом серебро специфично

122
восстанавливается рядом ядрышковых белков, которые называют на этом основании
аргентофильными. Явление окрашивания белков солями серебра называют
аргентофилией. Реакция серебрения проводится в строго контролируемых условиях, при этом интенсивность окрашивания и структура ядрышек, выявленная серебрением, позволяют судить об общем уровне транскрипционной активности клетки. Например, клетки активно пролиферирующих опухолей содержат повышенное содержание аргентофильных белков.
Некоторые из аргентофильных белков остаются связанными с рибосомными генами и при переходе клетки в митоз, когда синтез РНК прекращается, что позволяет установить, какие из ядрышковых организаторов были активны в предшествующей интерфазе. Т.е. если в ядрышковом организаторе в течении интерфазы транскрипция рибосомальных генов не происходила, то этот организатор в метафазе серебриться не будет. Например, в сперматогенезе и оогенезе изменения в окрашивании ядрышковых организаторов солями серебра хорошо коррелируют с изменениями в синтезе РНК. В частности, у Xenopus laevis аргентофильные белки начинают выявляться в ядрышковых организаторах только на той эмбриональной стадии, когда начинается транскрипция рибосомных генов.
2. Экспериментальная часть.
Процедура серебрения активных ядрышковых организаторов.
В цитологических и гистологических работах серебрение используется как метод, которым в зависимости от условий проведения реакции можно специфично окрасить разные структуры – ядрышки, кинетохоры, хромосомный скэффолд, границы клеток в эпителиях и т.п. В настоящее время серебрение широко используется также и в качестве метода окрашивания белков при проведении электрофореза.
В ходе выполнения задач настоящего практикума будет использоваться метод серебрения, описанный в работе Howell, Black (1980). В нем используются два раствора, которые смешиваются непосредственно перед применением. Первый раствор – нитрат серебра в деионизированной воде. Метод импрегнации серебром выдвигает повышенные требования к чистоте используемой посуды и реактивов. Если используется посуда из лабораторного стекла, то для успешного проведения реакции

123
посуда должна быть вымыта в концентрированной серной кислоте или в бихромат- серной кислоте (хромпике). Если используется пластиковая посуда, то пластик должен быть новым, а растворы серебра должны готовиться непосредственно перед применением. Соли серебра восстанавливаются под действием света, поэтому важно, чтобы все емкости, содержащие их, были завернуты в фольгу или черную бумагу.
Практическая работа №1: Выявление активных ядрышковых организаторов в хромосомных препаратах.
Цель работы: обучение методу выявления активных ядрышковых организаторов выделенных хромосом.
Объект исследования: клетки культуры HeLa.
Приборы и реактивы: покровные стекла с подготовленными хромосомными препаратами; чашки Петри диаметром 40 мм для промывки стекол; чашки Петри диаметром 90 мм для приготовления влажных камер; парафильм; 50 % раствор
AgNO
3
в деионизированной воде; раствор 2% желатина в 1% растворе муравьиной кислоты; краситель Гимзы; 0.1 М фосфатный буфер Зеренсена (pH 7.0); ксилол (или толуол); заливочная смесь DePex; фазово-контрастный микроскоп, оборудованный объективами 10х, 40х, 100х.
Последовательность экспериментальных операций:
1) Приготовление хромосомных препаратов как описано в Главе 10 (Практическая работа №1). От долгого хранения препараты портятся, поэтому наилучшее качество окрашивания достигается, если проводить серебрение на следующий день после раскапывания суспензии клеток на стекла.
2) Стекла помещают в чашки Петри диаметром 40 мм (так, чтобы препарат хромосом оказался сверху) вверх и промывают минимум в трех сменах деионизированной воды по 3-5 минуты в каждой. Важно помнить, что промывку необходимо производить в новой пластиковой чашке Петри (или другой чистой емкости).
3) Готовят влажную камеру.
4) В двух пробирках или эппендорфах готовят два красящих раствора.
Раствор 1 – 50 % раствор AgNO
3
в деионизированной воде. Если реакция ставится в течение дня несколько раз, можно приготовить несколько эппендорфов с небольшими навесками, к которым перед непосредственно перед использованием

124
добавлять необходимое количество деионизированной воды. При взвешивании нельзя пользоваться металлическими шпателями. Как уже упоминалось, нитрат серебра в растворе восстанавливается до металлического серебра на свету, поэтому пробирки следует обернуть фольгой или темной бумагой.
Раствор 2 – 2% желатина в 1% растворе муравьиной кислоты. Растворение желатины требует определенного времени, чтобы ускорить процесс, можно поставить приготовляемый раствор в термостат на 37°С.
5) На парафилм во влажной камере наносят равные объемы (примерно по 25-30 мкл, если используется покровные стекла 24
×24 мм) каждого из приготовленных растворов. Покровное стекло с раскапанными хромосомами достают из деионизированной воды пинцетом, кладут нижней стороной на кусочек чистой фильтровальной бумаги с тем, чтобы удалить капли воды; касаясь ребром стекла фильтровальной бумаги, по возможности удаляют жидкость и с поверхности стекла, на которой находятся хромосомы. Затем стеклом с препаратом накрывают каплю подготовленного красителя.
6) Окрашивание производят во влажной камере в защищенном от света месте.
Температуру окрашивания подбирают эмпирически, оптимальные результаты получают при температуре 37ºC. Окрашивание завершают, когда препарат приобретет темно-коричневый цвет (ориентировочно: 1-2 минуты при 60ºC, 10-12 минут при 37ºC).
7) Стекла возвращают в чашки Петри и промывают препараты в нескольких сменах деионизированной воды.
8) Для того, чтобы лучше выявить структуру хромосом, препараты можно докрасить красителем Гимзы. Время окрашивания и концентрацию красителя следует подбирать отдельно, используя для этого самые плохие препараты. Обычно хорошие результаты получаются при использовании 4% раствора красителя на 0.1
М фосфатном буфере Зеренсена, pH 7.0 (Приложение №). Время окрашивания примерно 3 минуты. Затем стекла промывают проточной водой и переносят в дистиллят.
9) Стекла с окрашенными препаратами высушивают при комнатной температуре, быстро промывают в ксилоле или толуоле и заключают в DePeX.

125 10) На правильно окрашенном препарате ядрышки и районы ядрышковых организаторов должны иметь темно-коричневый или черный цвет, тела хромосом
– светло-желтый или, если проводили докрашивание хромосом красителем Гимзы,
– голубой.
Практическая работа №2: Выявление активных ядрышковых организаторов в культивируемых клетках.
Цель работы: обучение методу выявления активных ядрышковых организаторов в клетках.
Объект исследования: клетки культуры HeLa.
Приборы и реактивы: буфер PBS (pH 7,4), клетки культуры ткани HeLa на покровных стеклах, свежеприготовленный раствор параформальдегида (3,7%); чашки
Петри диаметром 40 мм для промывки стекол; чашки Петри диаметром 90 мм для приготовления влажных камер; парафильм; 50 % раствор AgNO
3
в деионизированной воде; раствор 2% желатина в 1% растворе муравьиной кислоты; этанол (50%, 70%, 80
% и 96%); ксилол (или толуол); заливочная смесь DePex; фазово-контрастный микроскоп, оборудованный объективами 10х, 40х, 100х.
Последовательность экспериментальных операций:
1) Клетки фиксируют формальдегидом, пермеабилизируют и отмывают в PBS, как это описано в Главе 5.
2) Стекла помещают в новые пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм клетками вверх и промывают минимум в трех сменах деионизированной воды по 3-5 минуты в каждой.
3) Готовят влажную камеру (см. Глава 5). Необходимо обратить особое внимание на то, чтобы не испачкать парафильм.
4) В двух пробирках или эппендорфах готовят два красящих раствора.
Раствор 1 – 50 % раствор AgNO3 в деионизированной воде. Если реакция ставится в течение дня несколько раз, можно приготовить несколько эппендорфов с небольшими навесками, к которым перед непосредственно перед использованием добавлять необходимое количество деионизированной воды. При взвешивании нельзя пользоваться металлическими шпателями. Как уже упоминалось, нитрат серебра в растворе восстанавливается до металлического

126
серебра на свету, поэтому пробирки следует обернуть фольгой или темной бумагой.
Раствор 2 – 2 % желатина в 1 % растворе муравьиной кислоты. Растворение желатины требует определенного времени, чтобы ускорить процесс, можно поставить приготовляемый раствор в термостат на 37°С.
5) На парафильм во влажной камере наносят равные объемы (примерно по 15-20 мкл, если используется покровные стекла 12
×12 мм) каждого из приготовленных растворов. Покровное стекло с зафиксированными клетками достают из деионизированной воды пинцетом, кладут нижней стороной на кусочек чистой фильтровальной бумаги с тем, чтобы удалить капли воды с одной поверхности стекла; касаясь ребром стекла фильтровальной бумаги, по возможности удаляют жидкость и с поверхности стекла, на которой находятся клетки. Затем стеклом с препаратом накрывают каплю подготовленного красителя.
6) Окрашивание производят во влажной камере в защищенном от света месте.
Температуру окрашивания подбирают эмпирически. Наиболее быстро реакция проходит при 60ºC, однако очень хорошо реакция проходит и при температуре
37ºC. Окрашивание завершают, когда препарат приобретет темно-коричневый цвет (ориентировочно: 10 минут при 37ºC).
7) Стекла возвращают в чашки Петри и промывают препараты в нескольких сменах деионизированной воды.
8) Проводят заключение в синтетическую среду типа DePeX. Стекла с окрашенными препаратами обезвоживают в серии спиртов (50%, 70%, 80 % и две смены 96% этанола), промывают в ксилоле или толуоле и заключают в DePeX. (Подробнее эта процедура описана в Задаче №).
9) На правильно окрашенном препарате ядрышки и районы ядрышковых организаторов в митотических клетках должны иметь темно-коричневый или черный цвет, нуклеоплазма интерфазных ядер – светло-желтый, цитоплазма – едва заметный желтоватый оттенок. Структурно интерфазные ядрышки представляют собой скопление маленьких округлых гранул. Поскольку размер окрашенных серебром областей увеличивается в ходе окрашивания, при слишком длительном окрашивании отдельные гранулы могут сливаться, в результате число их может оказаться заниженным.

127
Глава 12.
Трансформация эукариотических клеток
1.Теоретическая часть.
Для исследования функциональной роли, пространственной организации и динамики различных клеточных компонентов важное значение имеет возможность направленно изменять геном клетки. Например, введение мутантных генов и экспрессия белков с измененной структурой могут быть использованы для анализа роли конкретных белков в клеточной физиологии. Использование генетически кодируемых молекулярных маркеров позволяет исследовать внутриклеточную локализацию белков-мишеней непосредственно в живых клетках. Большой популярностью в качестве таких меток в настоящее время пользуются конструкции на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP), впервые выделенного из клеток медузы, и его синтетических аналогов. Наиболее естественным способом введения таких меченых белков в клетку является трансфекция (перенос) в нее нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие белки. В результате трансфекции происходит временное или постоянное изменение генетического аппарата клетки, получившее название трансформация.
В качестве материала для трансфекции может использоваться как РНК, так и
ДНК. Благодаря более высокой устойчивости и возможности получения стабильно трансформированных клеток, большее распространение получила трансфекция плазмидной ДНК. Плазмиды для трансформации эукариотических клеток, помимо генетических элементов, необходимых для размножения плазмиды в бактериях, содержат ген, кодирующий исследуемый белок, а также гены, обеспечивающие селективную устойчивость трансфицированных клеток к какому-либо антибиотику, если задачей стоит получение стабильных трансформантов.
Размеры плазмидной
ДНК (10 3
-10 4
пар оснований в длину, гидродинамический диаметр превышает 100 нм) и отрицательный заряд молекулы препятствуют ее спонтанному проникновению в клетку. Кроме того, эндонуклеазы, которые присутствуют на внешней поверхности клетки, разрушают свободную ДНК в течение 30 минут. Первоначально, для преодоления этих ограничений использовали преципитацию ДНК в растворе фосфата кальция. Связывание ДНК с ионами Са++ частично нейтрализует ее отрицательный заряд, а копреципитация ДНК с Ca3(PO4)2 приводит к образованию компактных частиц, проникающих через плазматическую

128
мембрану. Для более эффективной трансфекции в настоящее время разработаны методы, основанные на формировании комплексов ДНК с поликатионными липидами.
Основными компонентами катионного липида являются: гидрофильный липидный «якорь», линкерный участок и положительно заряженная «голова». В состав липидного «якоря» входят либо остатки жирных кислот (чаще всего олеиновой или миристиновой), либо стерольные группы. Состав липидного «якоря» определяет параметры формируемого в комплексе с ДНК липидного бислоя такие, как гибкость и скорость обмена липидов. Линкерная группа определяет химическую стабильность, способность к био-деградации и эффективность трансфекции данным липидом.
Биодеградируемые липиды могут быть метаболизированы ферментами клетки, что уменьшает токсичность этих липидов для клетки. Положительно заряженная «голова» взаимодействует с отрицательно заряженной ДНК и, соответственно, участвует в образовании липосом. «Головной» участок различается по структуре в разных липидах и может нести одиночный или более высокий положительный заряд, в зависимости от присутствия первичных, вторичных, третичных и четвертичных аминов. Выпускают коммерческие поликатионные липиды для трансфекции – унифектин (“Unifect”), LIPOFECT AMINE (“Gibko”), ExGENE 500 (Euromedex) ,
FuGENE 6 (“Roche”).
2. Экспериментальная часть.
Методы трансформации эукариотических клеток.
Размер и стабильность комплекса ДНК и поликатионного липида определяет отношение зарядов в молекулах липида и ДНК, но не состав липида. Следует избегать соотношения зарядов 1:1, так как в этом случае формируются крупные агрегаты (более 1 мкм). Комплексы с суммарными положительными и отрицательными зарядами представляют собой структуры с различными способами расположения ДНК и липидов. В случае суммарного положительного заряда образуются везикулы с диаметром 300-700 нм и трансфекция происходит более эффективно. Добавление ДНК к липиду увеличивает размер формирующихся везикул. Добавление липидов к ДНК не приводит к такому увеличению до тех пор,

129
пока положительный заряд липидов превышает отрицательный заряд ДНК (Kennedi et al., 2000).
Изначально реагенты для трансфекции берутся в соотношении - 3 положительных заряда поликатионного липида к 1 отрицательному заряду ДНК.
Далее, оптимальное соотношение концентраций поликатионного липида и ДНК подбирается экспериментально.
Комплексы ДНК с липидами могут взаимодействовать с компонентами среды, сыворотки, внеклеточного матрикса и т. д. Компоненты сыворотки могут вызывать преждевременное освобождение ДНК из комплекса и усиливать ее деградацию нуклеазами. Помимо этого, бычий сывороточный альбумин, липопротеин, макроглобулин могут также влиять на размер везикул. Поэтому образование комплексов желательно проводить в среде без сыворотки (Zelphati et al.,
1998).
Агрегация ДНК с поликатионным липидом происходит быстро, а менее чем через 24 часа комплекс теряет активность. Для продления жизни комплексов используют полиэтиленгликоль, который включают в состав везикул. Содержащие полиэтиленгликоль везикулы не агрегируют и не взаимодействуют с компонентами сыворотки, что увеличивает их стабильность (Hong et al., 1997; Meyer et al., 1998; Mok et al., 1999) .
Цель работы: овладение навыками трансфекции эукариотических клеток.
Практическая задача: трансфекция клеток СПЭВ плазмидами, кодирующими GFP- ламин А.
Объект исследования: клеточная линия СПЭВ (эмбриональный почечный эпителий).
Приборы и реактивы: флуоресцентный микроскоп, ламинарный бокс, пластиковая посуда, культуральная среда 199, сыворотка КРС, антибиотик-антимикотик (Sigma), автоматические микропипетки (1000, 200 и 10 мкл), плазмида, Унифектин.
Последовательность экспериментальных операций:
Трансфекция эукариотических клеток Унифектином 56
ТМ
1) Накануне трансфекции клетки рассевают на 35 – мм чашки в количестве 1-3 Х 10 5
в
3 мл соответствующей ростовой среды. Клетки выращивают до достижения 60-80% конфлюентности.

130 2) 8 мкл Унифектина разбавляют в 100 мкл бессывороточной среды в микропробирке.
Важно добавлять унифектин непосредственно в среду, избегая попадания на стенки пробирки.
3) В отдельной микропробирке развести 2 мкг ДНК в 20 мкл бессывороточной среды или ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0).
4) По каплям добавить разведенный раствор Унифектина к раствору ДНК.
Пипетировать 2 раза. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре.
5) Добавить 80 мкл среды к раствору ДНК/Унифектина.
6) По каплям добавить раствор к клеткам в чашке Петри. Аккуратно перемешать раствор в чашке круговыми движениями.
7) Инкубировать клетки при 37º С в CO
2
инкубаторе, не меняя среду.
8) Анализировать клетки или клеточные экстракты для определения эффективности трансфекции через 16-72 часа.
9) Для получения стабильных трансфектантов через 48-72 часа после трансфекции клетки рассаживают в соотноршении 1/5-1/10 на селективной среде.
Трансфекция клеток с использованием Ca-фосфатного метода.
Для 35 мм чашки Петри:
Раствор А:
7.5 мкл плазмидной ДНК (концентрация ДНК 0.5 мкг/ мкл в ТЕ)
17.5 мкл 2М CaCl
2 117.5 мкл 0.2 x SSC
Раствор Б:
137 мкл 2 x HEBS
1) Подготовить растворы А и Б.
2) Смешать содержимое пробирок, чтобы образовался преципитат.
3) Добавить содержимое пробирки в чашку Петри к клеткам.
4) Инкубировать клетки с преципитатом в термостате в течение 4 часов.
5) Промыть клетки средой без сыворотки.
6) Добавить в чашку 15% глицерин в 1 x HEBS на 4 минуты.
7) Промыть клетки средой без сыворотки.
8) Инкубировать клетки при 37º С в CO
2
инкубаторе, не меняя среду.

131 9) Анализировать клетки или клеточные экстракты для определения эффективности трансфекции через 16-72 часа.
Буферы:
20 x SSC:
3 M NaCl
87.66 г
0.3 M
Na
3
C
6
H
5
O
7
x 5.5H
2
O 53.57 г дист. H
2
O до 500 мл
2 х HEBS:
NaCl - 8 г
KCl – 0.38 г
Na2HPO4 x 7
H
2
O 0.19 г
Глюкоза 1 г
HEPES 5 г pH 7.05 ± 0.05 (c NaOH)

1   2   3   4   5   6   7   8   9